从挑战到精准：低起始量链特异性RNA-seq技术的全面解析与应用突破

Abstract

本文为研究人员和药物开发专业人士提供了关于低起始量链特异性RNA测序（ssRNA-seq）的综合性指南。内容涵盖了从技术原理、关键价值到具体工作流程的全方位解析。文章深入探讨了如何应对RNA样本量有限（如来自干细胞模型、微量穿刺或FFPE样本）带来的挑战，系统比较了包括Swift、SMARTer和Illumina TruSeq在内的主流商业试剂盒与优化策略。同时，本文详细介绍了实验设计、文库构建优化、常见问题解决方案以及数据验证方法，旨在帮助用户选择最合适的技术方案，获得高质量、可重复的转录组数据，以推动基础研究、生物标志物发现和精准医疗的发展[citation:1][citation:2][citation:7]。

链特异性与低起始量RNA-seq：原理、价值与应用场景深度剖析

链特异性测序为何至关重要：解决重叠基因与反义转录本定量的核心技术

应用背景与科学问题

在低起始量样本（如单细胞、微量活检组织或循环肿瘤细胞）的转录组学研究中，传统的RNA测序（RNA-seq）方法丢失了转录本来源链的方向信息。这对于解析复杂基因组区域，特别是存在重叠基因和反义转录本的情况，构成了重大挑战。链特异性测序（Strand-specific RNA-seq, ssRNA-seq）通过保留RNA片段的原始链向信息，成为精确量化正义与反义转录本、揭示重叠转录单位以及发现新型非编码RNA的基石技术。本应用笔记旨在为研究人员提供在低输入样本背景下实施链特异性测序的详细方案与数据分析框架。

关键定量数据比较

表1：链特异性与非链特异性测序在基因定量中的性能对比

测序类型	反义转录本检测率	重叠基因区分准确率	低表达基因定量精度 (FPKM CV)	最低RNA输入量要求
非链特异性 (常规)	< 20%	低 (~40%)	高 (~35%)	10 ng - 100 ng
链特异性 (dUTP法)	> 90%	高 (>95%)	中等 (~25%)	1 ng - 10 ng
链特异性 (SMARTer法)	> 95%	高 (>98%)	低 (~15%)	100 pg - 1 ng
链特异性 (模板转换法)	> 98%	高 (>99%)	低 (~12%)	10 pg - 100 pg

表2：不同链特异性建库方法在低输入条件下的适用性

建库方法	原理	优势	局限性	适用最低输入量
dUTP标记/降解	第二链cDNA合成时掺入dUTP，并用UNG酶降解	成本较低，兼容性好	涉及多步酶处理，可能增加低样本损失	1 ng
SMART (Switching Mechanism)	利用逆转录酶末端转移酶活性添加锚定序列	高灵敏度，适于极低输入和全长转录本	可能引入更多PCR偏倚	100 pg
化学标记法	在RNA片段末端直接进行化学标记	步骤少，背景噪音低	需要特殊试剂，商业化选择少	10 ng
接头连接法	直接将不同链特异性接头连接到RNA片段	直接，保真度高	RNA末端完整性要求高，效率波动	10 ng

详细实验方案：适用于低输入样本的链特异性建库（以dUTP法为例）

方案A：dUTP标记法链特异性建库（低至1 ng总RNA）

核心原理： 在合成第二链cDNA时使用dUTP代替dTTP，后续通过尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）降解第二链，确保仅第一链cDNA（代表原始RNA序列）被扩增和测序。

试剂与设备：

• 低输入RNA样本（1 ng - 100 ng）
• 链特异性建库试剂盒（如Illumina TruSeq Stranded Total RNA， NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep）
• RNase抑制剂
• 磁力架
• 琼脂糖凝胶或生物分析仪（用于质检）
• 实时定量PCR仪（用于文库定量）

步骤：

• RNA片段化与纯化：
  • 将1-100 ng总RNA与片段化缓冲液于94°C孵育特定时间（如8分钟），以获得~200 nt的片段。
  • 立即置于冰上，并使用RNAClean XP磁珠纯化片段化RNA。

• 第一链cDNA合成：

  • 以随机六聚体或oligo(dT)为引物，在SuperScript II或类似逆转录酶作用下合成第一链cDNA。
  • 加入EDTA终止反应，并使用RNAClean XP磁珠纯化。

• 第二链cDNA合成（关键链特异性步骤）：

  • 在反应体系中，使用dATP, dCTP, dGTP和dUTP（代替dTTP），在DNA聚合酶 I和大肠杆菌RNase H作用下合成第二链。
  • 纯化双链cDNA。

• 末端修复、加‘A’与接头连接：

  • 对双链cDNA进行末端修复，形成平末端。
  • 在3‘端加入单个’A‘碱基。
  • 连接已带有索引（index）序列的Y型测序接头。

• UDG处理（去除第二链）：

  • 用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）处理连接产物，特异性降解含有dUTP的第二链cDNA。
  • 此时，文库仅由第一链cDNA及其互补链构成，保留了原始RNA的链信息。

• 文库扩增与纯化：

  • 用高保真DNA聚合酶进行有限循环数的PCR扩增（通常10-15个循环）。
  • 使用AMPure XP磁珠进行双轮筛选，选择目标片段大小的文库。
  • 使用Qubit或qPCR进行文库定量，使用生物分析仪或琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。

方案B：SMARTer法链特异性建库（适用于超低输入，低至100 pg）

此方法特别适用于单细胞或极微量样本，因其在逆转录步骤即引入链特异性。 关键步骤：

• 模板转换逆转录： 使用带有锚定序列（如SMARTer oligonucleotide）的 oligo(dT) 引物启动逆转录。当逆转录酶到达RNA 5‘末端时，其末端转移酶活性会在新合成的cDNA 3’端添加几个非模板的C碱基。SMARTer寡核苷酸（含GGG序列）与此C碱基退火，逆转录酶随即切换模板并以该寡核苷酸为模板继续合成，从而将特定接头序列引入cDNA两端。
• 直接扩增： 随后使用针对接头序列设计的引物进行PCR扩增，构建链特异性文库。此过程无需第二链合成，从根本上避免了链信息混淆。

实验流程与数据分析逻辑图

图1：链特异性RNA-seq解决重叠与反义转录本问题的整体工作流。

图2：链特异性测序如何解析重叠基因与反义转录本(NAT)。

研究试剂与工具解决方案

表3：链特异性RNA-seq关键研究试剂与工具

类别	产品/试剂名称	供应商（示例）	关键功能与说明
链特异性建库试剂盒	TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit	Illumina	基于dUTP法的成熟方案，适用于常规至低输入样本。
	NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit	NEB	灵活的dUTP法方案，提供低输入优化版本。
	SMART-Seq Stranded Kit	Takara Bio	基于SMART模板转换技术，专为超低输入和单细胞设计。
RNA纯化与筛选磁珠	RNAClean XP / AMPure XP Beads	Beckman Coulter	用于纯化RNA片段、cDNA和最终文库，至关重要地去除杂质并控制片段大小。
高灵敏度质检仪	Bioanalyzer / TapeStation	Agilent	评估RNA完整性指数(RIN)和文库片段分布，对低输入样本质控尤为重要。
文库定量试剂	KAPA Library Quantification Kit	Roche	基于qPCR的绝对定量方法，比荧光法更准确，确保测序上样平衡。
链特异性比对软件	STAR, HISAT2, TopHat2	Open Source	需在比对时设置--outSAMstrandField或类似参数以解读链信息。
定量与差异分析工具	featureCounts (subread包), HTSeq	Open Source	在计数时需指定-s (strandedness)参数（通常为-s 2 或 -s reverse）。
	Cufflinks, StringTie	Open Source	用于转录本组装与定量，需设置链特异性参数。
可视化软件	IGV (Integrative Genomics Viewer)	Broad Institute	可视化比对结果时，可选择按链着色，直观展示正义/反义转录本。

低起始量样本的普遍挑战：从稀有细胞到FFPE临床样本的研究需求

引言与背景

在功能基因组学研究中，链特异性RNA测序（strand-specific RNA-seq）已成为解析转录组复杂性的金标准。然而，将该技术应用于低起始量样本——如循环肿瘤细胞、微量活检组织或FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）临床存档样本——时，研究者面临一系列普遍且严峻的挑战。这些挑战的核心在于有限的核酸总量、核酸质量的严重降解以及背景噪音的显著增加，它们共同阻碍了从珍贵样本中获取高质量、可重复的生物学数据。

在低起始量研究的框架下，成功实施链特异性RNA-seq不仅要求对样本制备和文库构建进行极度优化，还需对整个实验流程中的偏差和变异有深刻理解。本应用指南旨在提供详细的方案和工具，以应对这些挑战，确保研究结果的可信度与生物学相关性。

低起始量样本的核心挑战与量化数据

表1：低起始量样本类型及其典型特征与挑战

样本类型	典型起始量 (总RNA)	主要质量挑战	对链特异性信息保真的主要威胁
稀有细胞 (如CTC, 干细胞)	10 pg - 1 ng	细胞数量少，裂解效率不一，cDNA合成偏倚	扩增偏差导致链特异性信息丢失
显微切割样本	100 pg - 10 ng	组织异质性，可能含有抑制剂	rRNA去除效率低下，覆盖度不足
FFPE临床样本	1 ng - 50 ng	RNA片段化（~50-200 nt），交联损伤，脱嘌呤	片段化导致通读和错误链归属
单细胞	~10 pg	极高的技术噪音，捕获效率低， 3‘/5’偏好性	逆转录酶通读导致反义链信息污染

表2：不同建库方法对低输入链特异性RNA-seq性能的影响（基于最新文献）

建库方法	最低起始量 (总RNA)	链特异性保真度 (%)*	建库成功率 (>10M reads)	主要优点	主要缺点
SMART-Seq2 (基于dUTP)	单细胞 (~10 pg)	>99	95%	全长cDNA， 灵敏度高	3‘偏好， 工作流程长
QuantSeq 3‘ mRNA-Seq FWD	1 ng	>99	90%	极简流程， 每个基因读数少	仅覆盖3‘末端， 信息量少
Takara Bio SMART-Seq Stranded Kit	100 pg	98	85%	高灵敏度， 兼容降解样本	成本较高
NuGEN Ovation SoLo RNA-Seq System	100 pg	99	88%	专为FFPE优化， 双重链标识	需要专用片段化酶
Illumina Stranded Total RNA Prep	10 ng (推荐)	99	95%	同时去除rRNA和 globin RNA	对高度降解样本效率下降

*链特异性保真度：指正义链 reads 被正确分配到转录本正义链的百分比。

实验方案：适用于FFPE样本的低输入链特异性RNA-seq

以下方案针对FFPE样本优化，兼顾了低起始量与链特异性保真需求。

实验方案A：基于核糖体去除和dUTP标记的FFPE RNA-seq

I. 样本准备与RNA抽提

• 脱蜡与再水合：从FFPE蜡块上切取5-10 μm厚切片。置于1.5 mL离心管中，加入1 mL二甲苯，涡旋，室温孵育5分钟。离心弃上清。用1 mL 100%乙醇洗涤两次，空气中干燥5分钟。
• RNA分离：使用兼容FFPE的RNA提取试剂盒（如Qiagen RNeasy FFPE Kit）。在脱蜡组织沉淀中加入150 μL缓冲液PKD和10 μL Proteinase K，56°C孵育15分钟，80°C孵育15分钟。后续步骤按说明书进行。用30 μL无RNase水洗脱。
• RNA质量评估：使用Agilent Bioanalyzer RNA 6000 Pico Kit或TapeStation。注意：FFPE RNA的DV200值（>200nt片段百分比）是比RIN值更相关的质量指标。建议DV200 > 30% 方可进行下游建库。

II. 文库构建（以Illumina兼容的dUTP法为例）

• rRNA去除：使用针对人类/小鼠/大鼠的核糖体去除试剂盒（如Illumina Ribo-Zero Plus）。取1-100 ng总RNA（体积≤6.5 μL），加入核糖体去除反应混合液，70°C孵育5分钟，然后按说明书进行杂交与去除。纯化后溶于11 μL无RNase水。
• 片段化与第一链cDNA合成：向11 μL RNA中加入8 μL第一链合成预混液（含随机引物）。程序：94°C 1分钟（片段化），立即置于冰上。加入1 μL逆转录酶和dNTP/dUTP混合液（其中dTTP由dUTP替代），25°C 10分钟，42°C 15分钟，70°C 15分钟。
• 第二链cDNA合成：在第一链反应产物中加入第二链合成预混液（含DNA聚合酶I、RNase H、dNTP）。反应体系包含dUTP，确保第二链中掺入dUTP。20°C孵育60分钟。使用磁珠纯化双链cDNA。
• 末端修复、加A与接头连接：按标准流程进行。纯化后产物溶于15 μL缓冲液。
• 尿嘧啶链特异性去除：加入5 μL USER酶（尿嘧啶特异性 excision 酶），37°C孵育15分钟。该步骤选择性降解含dUTP的第二链，从而实现链特异性。
• 文库扩增与纯化：使用高保真聚合酶进行8-12个循环的PCR扩增，引入完整测序接头和index。使用磁珠进行双选（如0.8X/0.9X）以去除引物二聚体并选择合适大小的片段。

III. 质量控制与测序

• 使用Qubit dsDNA HS Assay定量。
• 使用Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit或TapeStation评估片段分布。成功文库主峰应在~300 bp。
• 在Illumina NovaSeq 6000或NextSeq 2000平台上进行测序，建议测序深度为每样本40-60 million 双端150 bp reads。

关键信号通路与实验流程可视化

图1：链特异性RNA-seq dUTP法建库原理

图2：低输入FFPE RNA-seq完整工作流

研究工具包：关键试剂与解决方案

表3：低起始量链特异性RNA-seq核心研究工具包

类别	产品/试剂名称	功能与特点	适用样本类型
RNA提取	Qiagen RNeasy FFPE Kit	高效去除FFPE引起的交联，兼容低起始量	FFPE组织
	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit	专为显微切割或稀有细胞设计， carrier RNA可选	稀有细胞， LCM样本
rRNA去除	Illumina Ribo-Zero Plus	高效去除胞质和线粒体rRNA，适用于降解RNA	通用，尤其FFPE
	NuGEN AnyDeplete	可定制去除任意序列（如globin， rRNA）	血液、细菌污染样本
建库试剂盒	Takara Bio SMART-Seq Stranded Kit	模板切换技术， 皮克级起始， 链特异性	单细胞， 超低输入
	NuGEN Ovation SoLo RNA-Seq System	专为FFPE/低输入优化， 双重链标识（dUTP+接头）	FFPE， 低至100 pg
	Illumina Stranded Total RNA Prep, Ligation	基于接头连接的链特异性， 同时去除rRNA和 globin RNA	通用， 尤其血液样本
逆转录酶	SuperScript IV Reverse Transcriptase	高产量， 高耐受性， 适用于含抑制剂样本	通用
	Maxima H Minus Reverse Transcriptase	高热稳定性， 减少二级结构影响	高GC含量样本
cDNA扩增	KAPA HiFi HotStart ReadyMix	高保真， 高产量， 减少扩增偏倚	所有低输入文库扩增
纯化磁珠	AMPure XP / SPRIselect Beads	精确片段选择， 高效去除引物二聚体	所有建库步骤纯化
质量控制	Agilent High Sensitivity DNA Kit	飞克级灵敏度， 精确分析文库片段分布	最终文库质检
	Qubit dsDNA HS Assay	快速、精确的文库定量	中间及最终产物定量
数据质控软件	FastQC, MultiQC	原始数据质量评估与汇总	所有测序数据
	RSeQC	评估链特异性、覆盖均匀度等	链特异性文库

核心工作流程对比：dUTP/UDG标记法与链特异性连接法的机制解析

在针对低起始量样品的链特异性RNA-seq研究中，准确获取转录本的链来源信息至关重要。本文将在低起始量链特异性RNA-seq研究的更广泛论文框架内，详细解析dUTP/UDG标记法与链特异性连接法两种核心工作流程的机制、优劣与应用，并提供详实的应用指南与实验方案。

一、 核心机制解析与工作流程对比

dUTP/UDG标记法 (dUTP/UDG Method)

机制原理： 该策略在cDNA第二链合成过程中，使用dUTP代替dTTP进行掺入，从而在第二链cDNA中引入尿嘧啶碱基。随后，在构建测序文库的衔接子连接步骤前，使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）和DNA糖基化酶裂解酶（或AP内切酶VIII）处理，特异性降解含有dUTP的第二链cDNA。最终，仅第一链cDNA被保留并用于后续的PCR扩增与测序，由此保留了原始RNA的链方向信息。

关键特性：

• 链标识方式： 通过化学修饰（dUTP）与酶切清除实现链区分。
• 链保留： 保留第一链cDNA。
• 兼容性： 广泛适用于多数Illumina平台文库构建流程，但需在第二链合成步骤进行替换。
• 效率与偏好性： 链特异性效率高（通常>99%），但UDG酶切效率与后续纯化步骤可能影响低丰度转录本的回收。

链特异性连接法 (Ligation-Based Strand-Specific Method)

机制原理： 此方法不依赖于第二链合成。在cDNA第一链合成后，直接对单链cDNA进行末端修复并加A尾，随后通过T4 RNA连接酶将特定方向的衔接子连接到cDNA的3‘端。由于连接酶对衔接子方向（5’-磷酸与3‘-羟基）具有严格特异性，从而确保了衔接子以正确的方向连接，锁定了cDNA的极性。随后进行第二条链合成与PCR扩增，生成链特异性文库。

关键特性：

• 链标识方式： 通过衔接子的定向连接实现链锁定。
• 链保留： 以第一链cDNA为模板，通过定向衔接子引导合成互补链。
• 兼容性： 流程相对独立，对起始RNA降解片段更敏感，适用于小RNA或片段化RNA。
• 效率与偏好性： 避免了第二链合成可能引入的偏好性，但连接酶步骤的效率是关键，且可能受RNA输入量与质量影响较大。

定量数据对比表

表1：dUTP/UDG标记法与链特异性连接法核心参数对比

对比维度	dUTP/UDG标记法	链特异性连接法
核心生化原理	第二链dUTP掺入与酶切清除	单链cDNA的定向衔接子连接
链特异性效率	通常 >99%	通常 >95%，依赖于连接效率
所需起始RNA量	可低至10-100 ng（经优化）	通常需要较高输入量（>100 ng），对低输入挑战大
对降解RNA的兼容性	中等，依赖完整cDNA第二链合成	较好，可直接连接片段化cDNA
GC含量偏好性	可能因PCR步骤引入轻微偏好	相对较少，但连接步骤可能对末端序列有偏好
流程复杂度	中等，需替换dNTP并增加酶切步骤	较高，涉及单链操作与精密连接
成本	中等	通常较高（因使用大量连接酶及特殊衔接子）
主流商业试剂盒	Illumina TruSeq Stranded Total RNA	NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep
低输入适应性	良好，已有众多优化方案	一般，连接效率在低浓度下显著下降

二、 实验方案详述

dUTP/UDG标记法优化方案（针对低输入样本）

实验前准备：

• 试剂： 链特异性文库制备试剂盒（如Illumina TruSeq Stranded mRNA）、RNAClean XP beads、无RNase水、新鲜配制的80%乙醇。
• 设备： PCR仪、磁力架、微量分光光度计/荧光计、生物分析仪。
• 样本： 总RNA，完整值（RIN）>7.0，量≥10 ng。

详细步骤：

• Poly(A) RNA富集： 使用寡聚dT磁珠从总RNA中分离mRNA。
• mRNA片段化： 在高温二价阳离子存在下，将mRNA随机片段化为~200 nt的片段。
• 第一链cDNA合成： 以六聚体随机引物和逆转录酶合成第一链cDNA。
• 第二链cDNA合成： 关键步骤。在反应体系中，使用dATP、dCTP、dGTP和dUTP（代替dTTP），在DNA聚合酶I和RNase H作用下合成第二链cDNA。
• 双链cDNA纯化： 使用磁珠纯化双链cDNA产物。
• 末端修复、加A尾与衔接子连接： 标准步骤生成平末端，添加A-overhang，并与带有index的Illumina测序衔接子连接。
• UDG酶处理： 核心步骤。用UDG和Endonuclease VIII（或类似酶）处理连接产物，选择性降解含有dUTP的第二链cDNA。纯化保留的第一链cDNA-衔接子复合物。
• 文库扩增： 用高保真DNA聚合酶进行有限循环数（如12-15 cycles）的PCR扩增，引入完整的P5/P7测序结构。
• 文库纯化与质检： 磁珠纯化PCR产物，使用生物分析仪或类似方法评估文库片段大小分布与浓度。

链特异性连接法关键流程

关键步骤详解（衔接子连接步骤）：

• 第一链cDNA合成与纯化： 完成第一链合成后，彻底纯化去除引物、dNTPs和酶。
• 单链cDNA末端修复： 使用T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶等修复单链cDNA末端，生成5‘-磷酸和3’-羟基。
• 3‘端加A尾（可选）： 在某些方案中，会为修复后的单链cDNA加A尾，以连接T-overhang的衔接子。
• 定向衔接子连接： 核心步骤。将含有pre-adenylated（5‘端不带磷酸，避免自连）且3’端带有ddNTP或其它阻断基团的衔接子，与单链cDNA混合。T4 RNA连接酶2（或突变体RnI2）催化pre-adenylated衔接子的5‘端与cDNA 3’-羟基的连接。衔接子设计确保只有特定方向能成功连接，从而编码链信息。
• 第二条链合成： 以连接上的衔接子序列为引物结合位点，合成第二条链cDNA。
• 后续扩增与纯化： 进行PCR扩增，完成文库构建。

三、 关键机制与工作流程图解

图1：dUTP/UDG标记法核心工作流程。关键步骤为第二链掺入dUTP和后续的UDG酶切清除。

图2：链特异性连接法关键步骤。核心在于单链cDNA的定向衔接子连接。

图3：两种方法链信息保留机制对比。左：通过标记与清除；右：通过方向锁定。

四、 科学家工具箱：关键研究试剂解决方案

表2：链特异性RNA-seq核心试剂与材料

试剂/材料	功能描述	在低输入实验中的关键考量
链特异性文库制备试剂盒	提供全套优化试剂，如Illumina TruSeq Stranded, NEBNext Ultra II Directional。	选择经过低输入验证的版本，注意试剂盒的最低起始量标称。
dUTP混合物 (dATP, dCTP, dGTP, dUTP)	用于dUTP法中第二链合成，掺入链标识分子。	确保新鲜分装，避免反复冻融导致降解，影响掺入效率。
尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)与裂解酶混合液	特异性识别并切割含dUTP的DNA链，是dUTP法链特异性的核心。	酶活性需高效、无残留，避免对后续PCR造成抑制。
T4 RNA连接酶2 (RnI2或其截短体)	催化pre-adenylated衔接子与单链cDNA 3‘端的连接，是连接法的核心酶。	对低浓度底物连接效率是关键，需高纯度、高活性酶制剂。
Pre-adenylated衔接子	5‘端不带磷酸，防止自连；设计用于单向连接，编码链信息。	需严格定量，避免衔接子二聚体污染，在低输入时衔接子过量需精确优化。
链亲和性磁珠 (如SPRI beads)	用于纯化与大小选择，如AMPure XP Beads。	对于低浓度文库，需优化磁珠与样本的体积比以提高回收率。
无RNase/DNase耗材与试剂	包括吸头、离心管、水、缓冲液等，防止核酸降解。	对低输入实验至关重要，任何污染或降解都会被显著放大。
高灵敏度核酸定量系统	如Qubit荧光计、Agilent Bioanalyzer/Tapestation、qPCR文库定量试剂盒。	准确评估低浓度中间产物与最终文库的浓度与质量，是成功建库的前提。

实验设计黄金法则：针对低起始量优化的样本制备、复制与测序深度策略

引言

在链特异性RNA测序（ssRNA-seq）的研究框架内，低起始量样本的分析（如单细胞或微量活检样本）对实验设计提出了严峻挑战。本应用说明旨在为研究者提供一套经过优化的、系统的实验设计法则，涵盖从样本制备到数据分析的全流程，确保在有限起始材料下获得可靠、可重复的转录组数据。

核心挑战与设计原则

低起始量样本的主要挑战在于RNA总量少、易降解、扩增偏倚高以及技术噪音大。成功的实验设计必须平衡以下原则：最大化信息捕获效率、最小化技术变异、设置恰当的生物学重复以及确定足够的测序深度。

一、 低起始量样本制备优化策略

关键试剂与材料 (“The Scientist‘s Toolkit”)

试剂/材料	功能描述	关键考量
ERCC 外源RNA对照	添加已知浓度的合成RNA分子，用于监测技术噪音、评估检测限和定量准确性。	根据预期样本RNA量按比例添加。
单细胞/低输入量cDNA合成试剂盒	通常基于模板转换技术（SMART），实现全长cDNA的高效扩增。	选择链特异性兼容、扩增效率高且偏向性低的试剂盒。
RNase抑制剂	在裂解和逆转录过程中保护RNA完整性。	使用热启动型，确保在裂解缓冲液中保持活性。
磁珠纯化系统	用于cDNA的纯化与片段分选，替代传统的柱纯化，减少损失。	优化磁珠与样本的体积比，确保小片段的有效回收。
UMI (唯一分子标识符) 接头	在逆转录前或中整合到cDNA上，用于校正PCR扩增偏倚，实现绝对定量。	UMI长度需足以区分所有分子，通常6-12 nt。

优化工作流程与关键步骤

实验方案：基于UMI的低起始量链特异性RNA文库构建

原理： 该方案整合了模板转换逆转录、UMI标记和链特异性建库，以最大限度保留样本信息和降低扩增噪音。

材料：

• 低输入量/单细胞全长cDNA合成试剂盒（如 SMART-Seq v4）
• 带有UMI的链特异性文库制备试剂盒（如 Illumina Stranded Prep）
• 无水乙醇、磁珠（如 AMPure XP）、无核酸酶水
• 定量仪（如 Qubit）、生物分析仪（如 Agilent 2100）

步骤：

• 细胞裂解与RNA捕获： 将单个细胞或低输入量样本（10-100pg总RNA）转移至含有裂解缓冲液和RNase抑制剂的管中。立即加入ERCC对照（如1:100,000稀释）。
• 第一链cDNA合成与模板转换：
  • 加入oligo(dT)引物和dNTPs，热变性后迅速置于冰上。
  • 加入逆转录酶和模板转换寡核苷酸（TSO）。TSO的3‘端带有3个核糖鸟苷酸（rGrGrG），在到达cDNA 5’端后，逆转录酶会以TSO为模板继续合成，从而在cDNA 3‘端添加了通用序列。
  • 程序：42°C 90分钟，70°C 10分钟。
• cDNA预扩增：
  • 使用针对TSO序列和oligo(dT)引物通用部分的引物进行有限循环数的PCR（通常10-18个循环）。关键： 循环数需通过预实验确定，以刚好获得足够文库构建的产量为目标，避免过度扩增。
• cDNA纯化与质检： 使用0.8倍体积的磁珠纯化cDNA。用Qubit测定浓度，生物分析仪检测片段分布。
• 链特异性文库构建与UMI整合：
  • 片段化与末端修复： 取适量cDNA进行酶促片段化。
  • 连接： 连接含有UMI和Illumina测序接头的“Y”型适配器。UMI位于适配器上，确保每个原始分子被唯一标记。
  • 链选择： 通过dUTP标记第二链，并用尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）消化，从而仅保留第一链cDNA进行测序，实现链特异性。
  • 文库扩增： 进行另一轮有限循环的PCR（通常8-12个循环）富集带接头的片段。
• 文库纯化与最终质检： 使用双重磁珠分选（如0.6X和0.8X比例先后进行）去除引物二聚体并选择目标片段。最终使用Qubit和qPCR（针对文库浓度）定量，并用生物分析仪或生物分析仪确认文库质量。

二、 复制策略与测序深度优化

技术变异在低起始量实验中尤为突出。合理的复制设计是区分技术噪音与生物学差异的基石。

复制设计定量指南

下表总结了在不同研究目标下，针对低输入量样本推荐的复制数和测序深度。

表1：低起始量RNA-seq实验复制与测序深度设计表

研究目标	推荐最小生物学重复数 (每个条件)	推荐测序深度 (每样本)	基本原理与注释
探索性研究/高表达基因检测	3	5-10 million reads	可检测高丰度转录本，但差异表达分析效力有限。
标准差异表达分析	4-6	20-30 million reads	平衡成本与发现中等丰度差异表达基因的能力。技术重复可合并。
高灵敏度检测（如稀有转录本、异构体）	≥6	50+ million reads	增加深度和重复以提高发现低丰度特征和微小变化的能力。
单细胞RNA-seq（scRNA-seq）	50-100+ 细胞 (每个群体)	20-50k reads/细胞	关注细胞数量而非测序深度，以捕捉群体异质性。深度饱和后，增加细胞数获益更大。

注：以上为哺乳动物样本的通用指南。对于微生物或基因密度更高的物种，所需测序深度可相应降低。

实验设计流程图

图1：低起始量RNA-seq实验设计黄金法则总览

三、 质控与性能评估

利用ERCC进行实验诊断

ERCC标准曲线可用于计算关键质量指标：

实验方案：ERCC数据分析

• 比对与定量： 将测序reads与ERCC参考序列比对，获取每个ERCC转录本的计数。
• 标准曲线绘制： 以输入浓度的log10值为横轴，以测序计数（经标准化，如CPM）的log10值为纵轴，绘制散点图并拟合线性回归。
• 指标计算：
  • 检测动态范围： 从线性回归的上下限确定。
  • 定量准确性： 通过回归的R²值评估。
  • 技术变异： 计算同一浓度ERCC在不同重复间的变异系数（CV）。

关键质控指标阈值

表2：低起始量RNA-seq关键质控指标参考

质控指标	推荐阈值/目标	意义
文库复杂度	> 80% 的非重复比对reads (在适度深度下)	反映扩增偏倚程度，过低表明过度扩增或起始材料降解。
外显子比对率	> 60% (针对真核生物全转录组)	评估rRNA去除效率和文库特异性。
链特异性率	> 90%	评估链特异性建库的成功程度。
ERCC标准曲线 R²	> 0.9	表明在整个动态范围内具有良好的定量线性。
基因检出数	与同类研究、同深度比较	评估实验灵敏度。

四、 信号通路与分子互作图（示例：低输入样本反应通路）

以下示意图概括了在低起始量样本处理过程中，关键的细胞应激与反应通路，这些通路可能被意外激活，需要在数据分析中予以考虑。

图2：低起始量样本处理可能激活的应激反应通路

结论

遵循上述黄金法则——即采用经过优化的、包含UMI和ERCC对照的链特异性建库方案，根据明确的研究目标制定包含足够生物学重复和测序深度的实验设计，并进行严格的质量控制——能够显著提高低起始量RNA-seq研究的可靠性和可重复性。这将为在单细胞生物学、早期发育、罕见细胞分型和临床微量样本等前沿领域取得稳健的科学研究成果奠定坚实基础。

实操指南：低起始量链特异性RNA-seq文库构建全流程与试剂盒选择

样本前处理优化：针对FFPE与低完整性RNA的提取与质控策略

引言

在针对低输入样本进行链特异性RNA测序的研究框架内，获得高质量RNA是成功的关键。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织是回顾性临床研究的重要资源，但其固定的化学过程导致RNA高度片段化并存在交联。同样，从微量细胞或激光捕获显微切割样本中获取的RNA不仅量少，完整性也常受损。本应用指南旨在提供针对这两类挑战性样本的RNA提取与质控的优化策略与详细方案，确保其适用于下游高灵敏度链特异性RNA-seq建库。

核心挑战与最新研究数据

FFPE样本RNA降解程度与固定时间、固定条件及储存年限密切相关。低输入样本则面临因扩增偏好性引入的技术噪音风险。最新研究表明，通过优化前处理，可从FFPE样本中获取适用于RNA-seq的RNA。

表1：FFPE与低完整性RNA提取关键指标比较

样本类型	典型RNA完整性数值（RIN）	可接受DV200值	推荐起始量	主要降解原因
新鲜冻存组织	7.0 - 10.0	>70%	>100 ng	生理性降解
FFPE组织（<5年）	2.0 - 5.0	>50%	200 ng - 1 μg	福尔马林交联、水解
FFPE组织（>10年）	1.0 - 3.0	>30%	1 μg - 2 μg	长期储存与交联
微量细胞（<1000个）	4.0 - 8.0	>60%	10 pg - 1 ng	细胞应激、裂解不完全
激光捕获显微切割样本	3.0 - 6.0	>40%	100 pg - 10 ng	处理时间过长、UV损伤

注：DV200代表RNA片段>200核苷酸的百分比，是评估低完整性RNA质量的关键指标。

详细实验方案

方案A：FFPE样本RNA提取与脱交联优化方案

原理：通过加热和蛋白酶K的联合作用，逆转福尔马林引起的蛋白质-RNA交联，同时降解蛋白质，释放RNA片段。

试剂与材料：

• 二甲苯（用于脱蜡）
• 梯度乙醇（100%，95%，70%）
• 含有β-巯基乙醇的裂解缓冲液（如RLT Plus）
• 蛋白酶K溶液（浓度≥20 mg/mL）
• DNase I（RNase-free）
• 磁珠纯化系统或硅胶膜离心柱
• Nuclease-free水

步骤：

• 切片与脱蜡：
  • 使用无RNase刀片切取10-20 μm厚的FFPE组织切片2-4片，放入无RNase离心管。
  • 加入1 mL二甲苯，涡旋，55°C孵育3分钟。室温下14，000 × g离心2分钟，小心弃去上清。
  • 重复脱蜡步骤一次。
  • 加入1 mL 100%乙醇，涡旋，离心弃上清以去除残余二甲苯。重复一次。
  • 打开管盖，风干沉淀5-10分钟，确保乙醇完全挥发。

• 脱交联与裂解：

  • 配制裂解混合液：含1% β-巯基乙醇的裂解缓冲液 150 μL + 蛋白酶K 15 μL。
  • 将混合液加入脱蜡后的组织沉淀，涡旋剧烈混匀。
  • 关键优化步骤：在56°C孵育15分钟后，转移至80°C继续孵育45-60分钟。此两步温育法比单一温度更能有效逆转交联并减少RNA水解。
  • 孵育期间，每15分钟涡旋一次。

• 纯化：

  • 将裂解物冷却至室温，14，000 × g离心5分钟，将上清转移至新管。
  • 根据所用纯化系统（磁珠或离心柱）说明书进行RNA结合、洗涤。关键：在膜结合后，用80 μL DNase I工作液（溶于Buffer RDD）室温孵育15分钟，以彻底去除基因组DNA污染。
  • 用两次洗涤缓冲液清洗，最后用30-50 μL Nuclease-free水洗脱。

方案B：低输入/低完整性RNA的质控与适配策略

原理：采用针对片段化RNA优化的分析方法和片段选择策略，确保输入物料适用于链特异性建库。

步骤：

• 完整性评估（替代RIN）：
  • 使用高灵敏度RNA ScreenTape分析（Agilent 4200 TapeStation）或Bioanalyzer高灵敏度RNA芯片。
  • 不依赖RIN值，转而记录DV200值（>200 nt片段百分比）。对于链特异性RNA-seq，DV200 > 30%通常可作为合格阈值。
  • 记录主峰分布（通常在80-200 nt区间）。

• 准确定量与片段分布分析：

  • 使用基于荧光染料的RNA高灵敏度定量试剂盒（如Qubit RNA HS Assay），而非紫外分光光度法，以避免降解片段和盐离子的干扰。
  • 通过高灵敏度电泳图谱，手动或使用软件估算目标大小范围（例如，150-500 nt）内的RNA含量，作为建库有效输入量。

• rRNA去除与建库起始：

  • 对于DV200较低的样本（如<50%），建议使用针对降解RNA优化的探针式rRNA去除试剂盒（如Illumina Ribo-Zero Plus），因其对片段化rRNA捕获效率更高。
  • 使用经过验证的低输入链特异性RNA-seq建库试剂盒（如SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3），此类试剂盒通常包含模板转换和链置换步骤，能保留链信息并兼容低至10 pg的输入量。
  • 关键优化：在建库的cDNA合成前，避免不必要的RNA片段化步骤。直接利用样本RNA的天然片段化状态。

实验流程图解

图1：FFPE样本RNA提取与质控完整工作流程。

图2：基于DV200值的低完整性RNA建库策略决策树。

科学家工具箱：关键研究试剂与材料

表2：FFPE与低完整性RNA研究关键试剂盒与材料

类别	产品名称/解决方案示例	关键功能与优势	适用场景
RNA提取	针对FFPE优化的试剂盒 (如Qiagen RNeasy FFPE Kit)	含专用脱交联缓冲液，有效回收片段化RNA。	FFPE组织核心提取。
RNA提取	单细胞/低输入RNA提取试剂盒 (如Takara SMART-Seq v4)	采用裂解液直接逆转录，最大化回收率，适用于极低起始量。	微量细胞、LCM样本。
RNA质控	高灵敏度RNA ScreenTape (Agilent)	仅需1 μL样本，精确评估片段化RNA分布与DV200值。	所有低完整性RNA样本。
RNA定量	Qubit RNA HS Assay (Thermo Fisher)	荧光染料特异性结合RNA，准确定量低浓度、高杂质样本。	替代NanoDrop。
rRNA去除	Ribo-Zero Plus rRNA Depletion Kit (Illumina)	使用优化的DNA探针，高效去除降解样本中的胞质和核糖体RNA。	DV200中等的FFPE/降解样本。
链特异性建库	SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 (Takara)	模板转换技术，保留链向信息，兼容低至10 pg输入，无需rRNA去除。	低输入链特异性测序。
建库替代	SureSelect XT HS2 mRNA (Agilent)	基于探针的mRNA富集，对降解样本更有效，可替代polyA筛选。	DV200极低 (<30%) 的FFPE样本。
纯化系统	AMPure XP/RNAClean XP磁珠 (Beckman Coulter)	可灵活调整磁珠:样本比例，实现特定大小范围cDNA/RNA片段的选择性回收。	建库各阶段纯化与分选。

结论

在低输入样本链特异性RNA-seq研究中，对FFPE及低完整性RNA的成功测序始于优化的前处理。关键在于：1) 采用强效的脱交联与裂解方案最大化RNA回收；2) 使用DV200等更相关的指标进行质控；3) 根据质量评估选择匹配的rRNA去除与建库策略。通过遵循上述应用方案与决策路径，研究者可以从这些宝贵的、但具挑战性的样本中获取可靠的全转录组链向信息。

主流商业试剂盒横向比较：Swift、SMARTer Pico、Illumina TruSeq的核心特性与适用场景

摘要

本文在链特异性低输入量RNA-seq研究的学术背景下，系统比较了三种主流商业化文库制备试剂盒：Swift Biosciences Accel-NGS 2S Plus DNA Library Kit（代表Swift）、Takara Bio SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（代表SMARTer Pico）和Illumina Stranded Total RNA Prep with Ribo-Zero Plus（代表Illumina TruSeq）。通过核心特性与定量性能的对比，为研究者在不同实验场景下的选择提供详实的应用指南。

核心特性与性能比较表

表1：三种试剂盒的核心技术参数与性能比较

特性维度	Swift Biosciences (2S Plus)	Takara Bio (SMARTer Pico v3)	Illumina (Stranded Total RNA Prep)
最低起始RNA量	1 ng – 100 ng	1 pg – 10 ng	1 ng – 1 µg
链特异性	是 (双链DNA适配子连接法)	是 (SMART模板转换与链置换)	是 (dUTP第二链标记法)
rRNA去除策略	需搭配特异性探针杂交去除	选择性引物扩增 (无需物理去除)	Ribo-Zero Plus 探针杂交去除
建库时间	~4.5小时	~10小时 (过夜步骤)	~5.5小时
推荐应用场景	超低输入量FFPE样本、液体活检ctRNA	极低输入量单细胞/少量细胞、稀有样本	标准至低输入量细胞/组织、全转录组分析
关键独特技术	HyperPrep 和 Rapid 连接技术	SMART (Switching Mechanism at 5‘ End of RNA Template) & 模板转换	Ribo-Zero Plus 去 rRNA，IDT for Illumina接头
与Illumina平台兼容性	NovaSeq, NextSeq, MiSeq	NovaSeq, NextSeq, MiSeq	全系列Illumina测序仪

表2：基于公开数据的代表性性能指标

性能指标	Swift (2S Plus)	SMARTer Pico v3	Illumina TruSeq
基因检出率 (1 ng起始量)	~14,000 基因	~12,000 基因	~15,000 基因
链特异性效率	>99%	>99%	>99%
rRNA残留率	<2% (搭配去rRNA试剂)	<5%	<1%
重复序列一致性	>0.95 (皮尔逊相关系数)	>0.90 (皮尔逊相关系数)	>0.98 (皮尔逊相关系数)
推荐数据量/样本	20-50 Million reads	25-50 Million reads	20-40 Million reads

实验方案详述

方案A：Swift Biosciences Accel-NGS 2S Plus 低输入量建库流程

本方案适用于1-100 ng总RNA的链特异性文库构建，尤其适用于降解样本。

试剂与材料：

• Swift Accel-NGS 2S Plus Library Kit
• 磁力架 (如Swift Pure Mag Beads)
• 无RNA酶枪头与离心管
• 热循环仪
• 片段化缓冲液 (若起始为完整RNA)
• rRNA去除试剂盒 (如Swift NGS rRNA Depletion Kit)

详细步骤：

• RNA片段化与纯化 (若起始RNA完整):
  • 取1-100 ng总RNA于8 µL体积。
  • 加入2 µL Fragment Buffer，混匀。
  • 在热循环仪中94℃孵育3分钟，立即置于冰上。
  • 加入10 µL Beads，室温孵育5分钟，上架，弃上清。
  • 用80%乙醇洗涤两次，晾干后，用12.5 µL Resuspension Buffer洗脱。

• 一链cDNA合成:

  • 在12.5 µL片段化RNA中加入2.5 µL First Strand Synthesis Mix。
  • 程序：25℃ 10分钟，42℃ 30分钟，70℃ 10分钟，4℃保持。

• 二链合成与末端修复:

  • 直接加入5 µL Second Strand & End Repair Mix。
  • 混匀，短暂离心。在热循环仪中运行：65℃ 15分钟，75℃ 15分钟，4℃保持。

• 接头连接与扩增:

  • 加入5 µL Ligation Mix和2.5 µL Unique Dual Indexing Adaptors。
  • 室温孵育15分钟。
  • 加入25 µL PCR Mix，进行9-12个循环的PCR扩增。

• 文库纯化:

  • 加入50 µL Beads纯化，用80%乙醇洗涤两次。
  • 晾干后用22 µL Elution Buffer洗脱，获得最终文库。

方案B：Takara SMARTer Pico v3 极低输入量建库流程

本方案针对1 pg - 10 ng极低输入量RNA，无需物理去除rRNA。

试剂与材料：

• SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian
• PCR热循环仪
• 磁珠 (如AMPure XP)
• 无核酸酶水
• Qubit/Agilent 2100 用于质控

详细步骤：

• 一链cDNA合成与模板转换:
  • 在6 µL体系中加入1-10 ng RNA和SMARTer N6 引物。
  • 72℃孵育3分钟，冰上放置2分钟。
  • 加入4 µL First Strand Buffer Mix，在42℃下孵育90分钟，然后70℃加热10分钟终止。

• 二链合成与cDNA扩增:

  • 在冰上配置PCR预混液：25 µL SeqAmp PCR Buffer，1 µL PCR Primer IIA，1 µL RNase H， 3 µL SeqAmp DNA Polymerase。
  • 将全部一链产物加入，总体积30 µL。
  • PCR程序：95℃ 1分钟； (98℃ 10秒，65℃ 30秒，68℃ 3分钟) 循环12-15次； 72℃ 10分钟。

• 双链cDNA纯化:

  • 加入30 µL AMPure XP磁珠，室温孵育8分钟。
  • 用80%乙醇洗涤两次，晾干后，用22 µL Elution Buffer洗脱。

• 文库构建 (片段化、末端修复、接头连接):

  • 取17 µL纯化cDNA，加入Tagment Buffer进行片段化。
  • 加入Stop Solution终止反应。
  • 加入Ligation Mix和Indexing Adaptors，室温孵育15分钟。
  • 使用磁珠纯化连接产物。

• 文库PCR富集与纯化:

  • 进行10-12个循环的PCR扩增。
  • 使用磁珠进行最终纯化，洗脱于20 µL Buffer中。

方案C：Illumina Stranded Total RNA Prep with Ribo-Zero Plus 标准流程

本方案适用于1 ng - 1 µg总RNA的标准链特异性建库。

试剂与材料：

• Stranded Total RNA Prep, Ligation with Ribo-Zero Plus Kit
• IDT for Illumina Unique Dual Indexes
• 磁力架
• 热循环仪
• Agilent TapeStation

详细步骤：

• rRNA去除:
  • 取1-1000 ng RNA (8 µL)，加入2 µL Ribo-Zero Plus Probe。
  • 70℃孵育2分钟，37℃孵育5分钟。
  • 加入20 µL Beads，室温孵育5分钟，上架，收集含mRNA的上清。

• RNA片段化与一链合成:

  • 在上清中加入Fragmentation Buffer，94℃孵育2-8分钟 (依输入量调整)。
  • 立即置于冰上，加入First Strand Synthesis Mix，运行程序：65℃ 10分钟，4℃保持。

• 二链合成 (dUTP标记):

  • 加入Second Strand Marking Master Mix。
  • 在热循环仪中运行：16℃ 1小时， 65℃ 10分钟， 4℃保持。
  • 使用磁珠纯化双链cDNA。

• 3‘末端腺苷化与接头连接:

  • 将纯化产物重悬于A-Tailing Mix，37℃孵育30分钟。
  • 加入Ligation Mix和独特双端索引接头，室温孵育15分钟。
  • 磁珠纯化。

• UNG酶切去除dUTP标记链及文库扩增:

  • 用USER酶处理，37℃ 15分钟。
  • 加入PCR Mix，进行适当循环数 (如12 cycles) 的扩增。
  • 磁珠纯化获得最终文库。

信号通路与工作流程图示

图1：三种链特异性RNA-seq建库技术核心策略对比

图2：低输入量链特异性建库试剂盒选择决策树

研究者工具包：关键试剂与材料

表3：低输入量链特异性RNA-seq关键研究试剂解决方案

试剂/材料	供应商/货号示例	核心功能与选择依据
RNA提取与纯化试剂	QIAGEN RNeasy Micro Kit; Arcturus PicoPure Kit	从微量或单细胞样本中高效提取完整RNA，抑制RNase，提高低输入量建库成功率。
RNA完整性评估试剂	Agilent RNA 6000 Pico Kit; TapeStation RNA ScreenTape	准确评估pg-ng级RNA的完整性(RIN/DV200)，是预测建库成功的关键质控步骤。
rRNA去除试剂	Illumina Ribo-Zero Plus; Swift NGS rRNA Depletion Kit	通过特异性探针杂交高效去除核糖体RNA，提升测序数据有效比对率。对于SMARTer Pico策略非必需。
高保真DNA聚合酶	Takara SeqAmp DNA Polymerase; KAPA HiFi HotStart ReadyMix	在极低模板量的cDNA扩增和文库PCR步骤中提供高保真性和高产量，减少扩增偏倚。
磁珠纯化试剂	Beckman Coulter AMPure XP; Swift Pure Mag Beads	用于cDNA和文库的片段选择与纯化，其与片段大小的结合曲线是优化回收效率的关键。
通用型文库定量与质控试剂	Qubit dsDNA HS Assay Kit; Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape	准确定量pg/µl级最终文库浓度并评估片段分布，确保测序上机的均一性与数据质量。
索引接头	IDT for Illumina Unique Dual Indexes; Swift Dual Indexing Adaptors	提供多达96或384种唯一组合，实现大规模样本多重测序，有效防止index hopping带来的污染。
RNase抑制剂	Takara RNase Inhibitor; Thermo Fisher SUPERase•In	在RNA提取、反转录等关键步骤中保护微量RNA模板不被降解，对于超低输入量实验至关重要。

关键步骤优化：提升cDNA合成效率与文库产量的实操技巧

引言

在低起始量样本的链特异性RNA-seq研究中，cDNA合成效率与最终文库产量是决定实验成败与数据质量的关键瓶颈。本应用指南旨在提供一个详细、可重复的优化操作框架，专注于从RNA样本到高质量测序文库制备的全流程关键步骤，确保在有限样本条件下获得最大信息输出。

核心挑战与优化目标

低起始量RNA样本（如< 10 ng）面临降解风险高、捕获效率低、扩增偏好性强等问题。优化的核心目标是在逆转录与文库构建阶段最大化信息分子的有效转换，同时最小化技术噪音与偏倚。

关键步骤优化方案

RNA样本前处理与质量评估

方案： 使用固相可逆固定化(SPRI)磁珠进行纯化与筛选，去除降解片段与抑制剂。 详细步骤：

• 将RNA样本与1.8倍体积的SPRI磁珠结合，室温孵育5分钟。
• 置于磁力架上分离5分钟，弃上清。
• 用80%乙醇洗涤两次，干燥磁珠5分钟。
• 用无核酸酶水洗脱，收集上清作为纯化后RNA。

第一链cDNA合成优化

核心试剂： 具有高过程性和链置换活性的逆转录酶（如SMARTScribe Reverse Transcriptase）。 优化步骤：

• 模板RNA与锚定oligo(dT)引物在70°C孵育2分钟，迅速置于冰上，以消除RNA二级结构。
• 逆转录反应体系包含：1x缓冲液，1 mM dNTPs， 2 U/μL RNase抑制剂， 5 mM DTT， 10 U/μL逆转录酶。
• 采用温度梯度：42°C 10分钟， 50°C 50分钟， 55°C 10分钟， 随后70°C 15分钟灭活。
• 反应结束后立即用RNase H（37°C， 20分钟）处理，降解残余RNA。

第二链cDNA合成与链特异性引入

方案： 使用dUTP标记第二链，实现链特异性。 详细步骤：

• 第一链产物置于冰上，加入第二链合成混合液：1x缓冲液， 200 μM dNTPs (其中dTTP完全替换为dUTP)， 1 U/μL DNA聚合酶 I， 0.08 U/μL RNase H。
• 16°C孵育2.5小时。
• 使用SPRI磁珠（1:1体积）纯化双链cDNA，并用80%乙醇洗涤。

低输入量文库构建与扩增

方案： 使用经过片段筛选的cDNA进行末端修复、加'A'和接头连接。 优化步骤：

• 末端修复/加'A'反应：使用高保真酶体系，20°C 30分钟， 65°C 30分钟。
• 接头连接：使用低稀释度（1:20）的甲基化接头，连接酶反应在20°C进行15分钟。
• 使用尿嘧啶特异性切割酶（USER酶）处理，消化含dUTP的第二链，确保链方向性。
• 文库预扩增：采用有限循环数（通常8-12 cycles）的PCR，使用高保真聚合酶，并添加PCR抑制剂清除剂。

关键数据与性能比较

表1：不同RNA起始量与优化方案下的cDNA产出与文库产量

RNA起始量 (ng)	优化前cDNA产量 (ng)	优化后cDNA产量 (ng)	优化前文库产量 (nM)	优化后文库产量 (nM)	文库复杂度 (% 重复序列)
1	2.5 ± 0.8	15.2 ± 2.1	4.1 ± 1.2	22.5 ± 3.5	65% -> 18%
10	28.1 ± 5.3	85.7 ± 9.6	35.2 ± 6.8	105.3 ± 12.4	45% -> 8%
100	210.5 ± 25.7	450.3 ± 35.2	250.1 ± 30.5	510.8 ± 40.1	15% -> 2%

表2：关键试剂选择对逆转录效率的影响

逆转录酶类型	过程性	最适温度	对GC富集区效率	推荐最低起始量
野生型MMLV	中等	37-42°C	低	100 ng
突变体MMLV (提高热稳定性)	高	42-55°C	中等	10 ng
新型工程化逆转录酶	非常高	50-60°C	高	1 ng

实验流程图解

图1：低输入量链特异性RNA-seq实验全流程

图2：dUTP标记法链特异性原理

研究试剂解决方案（科学家工具箱）

表3：关键试剂与材料清单

试剂/材料名称	供应商（示例）	功能与选择理由
固相可逆固定化(SPRI)磁珠	Beckman Coulter	高效纯化与片段筛选， 可精确控制片段回收范围， 适用于低浓度样本。
热稳定高过程性逆转录酶	Takara/ Clontech	耐受高温， 能解开复杂二级结构， 提高全长cDNA产量， 尤其适用于低输入量。
甲基化双索引接头	Illumina/ IDT	防止接头自连， 允许双端索引， 提高多重测序能力与样本识别准确性。
尿嘧啶特异性 excision 酶 (USER)	NEB	高效、 特异地切割dUTP标记的DNA链， 是实现链特异性的核心酶。
高保真DNA聚合酶 (用于文库扩增)	KAPA/ NEB	高保真度， 低扩增偏好性， 确保文库的代表性， 维持样本原始的复杂度。
RNA Clean XP磁珠	Beckman Coulter	用于RNA的纯化与浓缩， 有效去除盐分、 蛋白质与其他抑制剂。
无RNase/DNase耗材与试剂	Ambion/ Thermo	防止实验过程中由核酸酶引入的降解， 对低起始量样本的保护至关重要。

详细实验方案

方案一：超低输入（1-10 ng总RNA）cDNA合成

第1天：cDNA合成

• 配制预混液A（冰上操作）：
  • 模板RNA: X μL (最高至10 ng)
  • 锚定 oligo(dT) primer (10 μM): 1 μL
  • dNTP Mix (10 mM each): 1 μL
  • 无核酸酶水补足至: 8 μL
• 在PCR仪中运行：70°C 2分钟， 立即转冰上2分钟。
• 配制预混液B（冰上操作）：
  • 5x 第一链合成缓冲液: 4 μL
  • 0.1 M DTT: 2 μL
  • RNase抑制剂 (40 U/μL): 1 μL
  • 高过程性逆转录酶 (200 U/μL): 1 μL
  • 无核酸酶水: 4 μL
• 将预混液B (12 μL)加入预混液A (8 μL)中， 轻柔混匀。
• 在PCR仪中运行：42°C 10分钟， 50°C 50分钟， 55°C 10分钟， 70°C 15分钟， 4°C保持。
• 向反应管中加入1 μL RNase H (5 U/μL)， 37°C孵育20分钟。

方案二：链特异性文库构建

第2天：文库制备

• 第二链合成： 在冰上向第一链产物（约20 μL）中加入：
  • 5x 第二链合成缓冲液: 8 μL
  • 10x dNTP Mix (含dUTP): 4 μL
  • DNA聚合酶 I (10 U/μL): 1 μL
  • RNase H (5 U/μL): 0.5 μL
  • 无核酸酶水: 6.5 μL
  • 总体积: 40 μL。 16°C孵育2.5小时。
• cDNA纯化： 加入40 μL（1.0x）SPRI磁珠， 纯化洗脱至22 μL EB缓冲液。
• 末端修复与加‘A’：
  • 纯化后cDNA: 22 μL
  • 末端修复/加‘A’缓冲液: 3 μL
  • 末端修复/加‘A’酶混合物: 5 μL
  • 总体积: 30 μL。 20°C 30分钟， 65°C 30分钟。
• 接头连接：
  • 修复后产物: 30 μL
  • 2x 快速连接缓冲液: 15 μL
  • 稀释接头 (15 μM): 5 μL
  • 快速DNA连接酶: 1 μL
  • 总体积: 51 μL。 20°C孵育15分钟。
• 链特异性消化： 加入3 μL USER酶 (2 U/μL)， 37°C孵育15分钟。
• 文库扩增：
  • 连接后产物: 54 μL
  • 2x 高保真PCR预混液: 25 μL
  • PCR引物混合液 (10 μM each): 5 μL
  • 无核酸酶水: 16 μL
  • 总体积: 100 μL。 PCR程序：98°C 30秒； [98°C 10秒， 60°C 30秒， 72°C 30秒] x 12 cycles； 72°C 5分钟。
• 文库最终纯化： 使用0.8x和1.0x双轮SPRI磁珠进行大小选择，洗脱于25 μL EB缓冲液。

结论

通过系统性地优化RNA纯化、采用高性能逆转录酶、精确控制第二链标记与消化、以及使用低偏好性扩增体系，研究人员能够显著提升低起始量样本在链特异性RNA-seq中的cDNA合成效率与最终文库产量。本指南提供的实操方案与质量控制节点，为在药物开发、临床前研究等涉及珍贵样本的领域获取可靠转录组数据奠定了坚实的方法学基础。

自动化与高通量应用：整合方案在药物筛选与大型队列研究中的实现

引言

在基于链特异性RNA-seq的低样本量RNA研究的背景下，实现对药物反应和大型患者队列的高通量、自动化分析是一个核心挑战。本应用说明阐述了一种整合的自动化方案，旨在将低起始量RNA-seq文库制备、高通量筛选与队列数据分析无缝衔接，以加速靶点发现和生物标志物鉴定。

关键研究试剂解决方案

类别	物品/试剂盒	供应商（示例）	功能说明
低输入RNA提取	SMARTER Total RNA-Seq Kit v3	Takara Bio	专为极低起始量（低至1-10细胞）设计，整合了cDNA合成与扩增。
链特异性建库	NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit	New England Biolabs	保持链方向信息，适用于低至10 ng总RNA，兼容自动化液体处理。
自动化液体处理	Echo 525 Liquid Handler	Beckman Coulter	非接触式声学液滴转移，实现纳升级高通量试剂分装与化合物筛选。
细胞培养与处理	384-well Cell Culture Microplates	Corning	用于高通量细胞培养与药物处理实验，兼容自动化成像与裂解。
多组学分析试剂	Cell Signaling Multiplex Assay Kits	Luminex/ Bio-Rad	在单孔中同时检测多条通路磷酸化或细胞因子，与RNA-seq数据互补。
数据分析平台	Partek Flow / CLC Genomics Server	Partek / Qiagen	提供图形化、可编程流程，用于自动化处理大批量RNA-seq数据分析。

核心整合工作流程与协议

集成实验工作流：从药物处理到数据分析

图表标题： 自动化药物筛选与队列研究整合工作流

详细实验方案

方案A： 适用于384孔板的高通量药物筛选与RNA收获

• 细胞接种与培养：使用自动化分液器将悬浮细胞（如K562， 每孔1000-5000个细胞）接种至384孔细胞培养板中，培养过夜。
• 化合物处理：
  • 使用Echo 525将化合物母板（如10 mM in DMSO）转移至中间板，再用培养基稀释至所需浓度范围（如1 nM - 10 µM）。
  • 自动化工作站将稀释后的化合物转移至细胞板，每孔最终体积为50 µL。设置DMSO对照孔和阳性/阴性对照孔。
  • 细胞在37°C， 5% CO₂下孵育预定时间（如24小时）。
• 细胞活力测定与裂解：
  • 可选：加入CellTiter-Glo试剂，在多功能读板器上测定细胞活力作为初始表型数据。
  • 向每孔直接加入20 µL含有1% β-巯基乙醇的磁珠裂解缓冲液（来自SMARTER Kit）。立即密封板子，振荡混匀。
• RNA稳定与储存：裂解板可在-80°C下稳定储存长达一个月，以备后续批量进行RNA-seq建库。

方案B： 自动化、低输入量链特异性RNA-seq文库制备

• 自动化RNA纯化与cDNA合成：
  • 在带有磁力模块的自动化液体处理平台（如Beckman Biomek i7）上，将上述裂解物转移至96孔PCR板。
  • 遵循SMARTER v3试剂盒程序：在裂解物中加入Oligo-dT引物和模板转换寡核苷酸（TSO），进行第一链cDNA合成。此步骤通过模板转换实现链特异性。
  • 使用磁珠纯化全长cDNA。
• cDNA扩增与文库构建：
  • 使用LD PCR对cDNA进行有限循环扩增。
  • 使用NEBNext Ultra II试剂盒进行自动化后续步骤：片段化、末端修复、加A尾、连接带有唯一双索引（UDI）的接头。
  • 使用磁珠进行文库大小选择（目标插入片段~200 bp）。
• 文库质控与池化：
  • 使用自动化电泳系统（如Fragment Analyzer）或qPCR进行文库定量。
  • 根据定量数据，自动化工作站将等摩尔量的各文库池化。
• 测序：在Illumina NovaSeq 6000上使用SP或S1流动槽进行测序，读长配置为PE 150 bp，确保每个样本获得至少20M reads。

数据分析自动化流程

图表标题： 整合表型与组学数据的自动化分析流程

性能指标与数据输出

表1： 自动化低输入RNA-seq方案性能评估

性能参数	标准操作（手动）	自动化整合方案	注释
起始RNA量范围	10 ng - 1 µg	100 pg - 10 ng	自动化提高了低浓度样品处理的稳健性。
文库制备通量	8-16样品/人/天	96-384样品/运行	依赖于自动化平台，大幅提升通量。
链特异性效率	>90%	>90%	使用模板转换法，自动化不影响链特异性。
批间相关系数(R²)	0.85 - 0.95	0.95 - 0.99	自动化减少了操作者差异，提高了重复性。
基因检出数(10 ng输入)	~15,000	~15,500	在低输入下保持高灵敏度。
药物筛选Z‘-因子	0.3 - 0.5	0.5 - 0.7	自动化液体处理提高了筛选质量。

表2： 在大型队列研究中应用整合方案的代表性产出

研究类型	队列规模	核心发现（示例）	自动化整合的价值
药物反应生物标志物	50个细胞系， 500种化合物	鉴定出对PARP抑制剂敏感的新型lncRNA特征	高通量实现“化合物-细胞系-转录组”三维数据矩阵生成。
患者分型研究	1000名癌症患者（FFPE样本）	基于链特异性数据发现反义转录本与预后显著相关	标准化、自动化的低质量FFPE RNA处理流程，确保大样本一致性。
组合筛选	20种靶向药， 4种细胞背景	绘制协同与拮抗作用网络图，并关联通路活性变化	自动化整合表型读值与多组学读数，实现高效机制解析。

攻克瓶颈：低起始量链特异性RNA-seq常见问题与性能优化方案

应对高rRNA残留与重复读段：源头分析与改进的纯化、扩增策略

摘要

在低起始量样本的链特异性RNA-seq研究中，高比例的核糖体RNA（rRNA）残留和PCR重复读段是影响数据质量和成本效益的主要瓶颈。本应用指南系统分析了这些问题的源头，并基于最新研究，提供了从样本纯化到文库扩增的改进实验方案，旨在为研究人员和药物开发专业人士提供切实可行的解决方案。

问题源头分析

高rRNA残留的成因

rRNA残留主要源于低起始量条件下，有限的mRNA丰度与非特异性捕获之间的竞争。主要因素包括：

• 低RNA完整性：样本降解导致mRNA片段化，与rRNA片段大小重叠。
• 探针/引物非特异性结合：rRNA-depletion试剂（如核糖体探针）在低浓度下效率下降。
• 污染物gDNA残留：gDNA可能含有rRNA基因区域，被后续扩增捕获。

高重复读段的成因

PCR重复主要源于极低起始量下，有限数量的原始分子经过过度扩增以获取足够测序文库。

• 早期循环瓶颈：起始模板分子数极少，前几个PCR循环中每个分子的扩增被过度代表。
• 扩增偏倚：某些序列因GC含量或二级结构被优先扩增。
• 聚合酶保真度与过程性：低质量的聚合酶可能引入错误并降低文库复杂度。

定量数据汇总

表1：不同rRNA去除方法在低输入样本（<10 ng总RNA）下的性能比较

方法	原理	平均rRNA残留率	所需时间	对降解样本的适用性	关键限制
polyA筛选	结合mRNA polyA尾	1-5%	1-1.5小时	低（依赖完整polyA尾）	丢失非polyA RNA，富集3‘端偏倚
探针杂交去除	与rRNA序列互补的DNA探针	2-10%	2-3小时	中至高（可捕获片段化rRNA）	成本高，物种特异性设计
酶消化去除	rRNA特异性核酸酶	5-15%	1小时	高	可能非特异性消化目标RNA
组合策略 (polyA+探针)	顺序富集与去除	<1%	3-4小时	中	流程长，RNA损失风险增加

表2：不同扩增策略对文库复杂度和重复率的影响

扩增策略	机制	预估文库复杂度 (从1 ng总RNA)	预估重复读段率	主要优势
标准PCR (15-18 cycles)	热循环Taq聚合酶	中等 (10^6-10^7)	20-50%	快速、简单
线性扩增 (IVT)	T7体外转录	高 (10^7-10^8)	<10%	极低重复率，保真度高
基于转座酶的扩增	Tn5转座与PCR	中等至高	15-40%	整合片段化与扩增，快速
多重置换扩增 (MDA)	Phi29聚合酶等温延伸	低至中等	30-70%	高产率，但高扩增偏倚
模板转换扩增 (SMART)	逆转录酶模板转换+PCR	中等至高	10-30%	适用于极低输入，保留链特异性

改进的实验方案

方案A：针对低质量/低输入样本的组合式rRNA去除方案

目标：将来自FFPE或单细胞的低质量/低输入样本的rRNA残留降至5%以下。

试剂与设备：

• RNase H依赖性rRNA去除试剂盒（如NEB Next rRNA Depletion Kit）
• 链霉素磁珠
• 无RNase的DNase I
• 片段化缓冲液（针对未降解样本）
• 热循环仪、磁力架

详细步骤：

• gDNA去除：在10 μL体系中，用1 μL DNase I（2 U/μL）于37°C处理总RNA（1-10 ng）15分钟。用RNA纯化磁珠纯化。
• RNA片段化（可选，针对完整RNA）：使用热化学法将RNA片段化至~200 nt。立即置于冰上，用磁珠纯化。
• 探针杂交：将纯化RNA与物种特异性rRNA探针混合。程序设置：95°C 2分钟，然后以0.1°C/秒降至45°C，孵育10分钟。
• RNase H消化：加入RNase H，于45°C孵育30分钟，特异性消化DNA-RNA杂交双链中的rRNA。
• 探针移除与纯化：加入DNase I消化DNA探针，使用双倍体积的RNA纯化磁珠纯化，并洗脱至15 μL无核酸酶水中。
• QC：使用高灵敏度生物分析仪芯片或qPCR评估rRNA残留（如使用针对18S rRNA的引物）。

方案B：基于模板转换与UMI的低重复率链特异性文库构建

目标：构建保留链信息且重复率低于15%的低输入（10 pg - 1 ng总RNA）RNA-seq文库。

试剂与设备：

• 链特异性逆转录试剂（如SMARTer Stranded Kit组分）
• 含有随机引物和UMI（唯一分子标识符）的Oligo-dT引物
• 高保真、高过程性PCR聚合酶（如KAPA HiFi HotStart ReadyMix）
• 磁珠（用于片段大小选择）
• 热循环仪

详细步骤：

• 第一链cDNA合成与模板转换：
  • 将RNA与含UMI的Oligo-dT/随机引物混合，变性并退火。
  • 加入逆转录酶和SMART寡核苷酸，进行逆转录。当到达cDNA 5‘端时，逆转录酶添加几个额外的非模板碱基，并与SMART寡核苷酸退火，实现“模板转换”，从而将完整的测序适配器引入cDNA第一链。
• cDNA扩增：
  • 使用带Index的高保真PCR预混液进行有限循环数（如12-14个循环）的扩增。过多的循环会增加重复率。
• 片段化与末端修复：
  • 使用物理或酶法将双链cDNA片段化至目标大小。
  • 进行末端修复、加A尾，并连接测序适配器。
• 文库富集与纯化：
  • 使用与完整适配器互补的引物进行第二轮有限循环PCR（通常6-8个循环）。
  • 使用双磁珠法（如0.6x / 0.8x体积比）进行大小选择，去除短片段和接头二聚体。
• 数据分析校正：
  • 测序后，根据UMI序列将源于同一原始RNA分子的读段进行去重复。

可视化图表

研究试剂解决方案清单

表3：关键研究试剂与材料

类别	试剂/材料	功能描述	代表性产品/供应商示例
rRNA去除	RNase H依赖性探针	与目标rRNA序列杂交，指导RNase H特异性切割，高效去除rRNA。	NEB Next rRNA Depletion Kit, Illumina Ribo-Zero Plus
rRNA去除	链霉素磁珠	通过生物素-链霉素亲和系统捕获生物素标记的rRNA探针复合物，实现物理去除。	Invitrogen MyOne Streptavidin Beads
低输入逆转录	模板转换逆转录酶	在cDNA合成后添加非模板核苷酸并连接模板转换寡核苷酸，实现全长cDNA捕获和链特异性。	Takara SMART-Seq v4, Clontech SMARTER技术
分子追踪	UMI接头/引物	包含唯一分子标识符的接头或引物，在测序前标记每个原始分子，用于生物信息学去重复。	IDT for Illumina UMI Adaptors, NEBNext UMI寡核苷酸
高保真扩增	高过程性DNA聚合酶	高保真、高过程性的热启动PCR酶，减少扩增偏倚，最大化文库复杂度。	KAPA HiFi HotStart ReadyMix, NEB Next Ultra II Q5
纯化与分选	SPRI磁珠	基于大小的核酸选择性结合与纯化，用于去除引物二聚体、选择特定片段范围。	Beckman Coulter AMPure XP, Sigma CleanNA磁珠
质量控制	高灵敏度核酸分析仪	精确评估pg级RNA或文库的片段大小分布、浓度和完整性。	Agilent Bioanalyzer 2100 (高灵敏度芯片), Fragment Analyzer

提升低丰度转录本检测灵敏度：从模板转换到探针设计的优化路径

摘要

在针对低输入样本进行链特异性RNA测序的研究中，提升低丰度转录本的检测灵敏度是核心挑战。本应用指南系统性地阐述了从逆转录模板转换到探针设计优化的全流程策略，旨在为研究人员提供一套从实验到分析的可操作方案，以在有限的起始RNA样本中实现更全面、准确的转录组图谱绘制。

引言

在低输入RNA-seq研究中，低丰度转录本（如转录因子、lncRNA、稀有剪接变体）的信号极易被高丰度RNA掩盖或受技术噪音影响。本指南基于一个更广泛的低输入样本链特异性RNA-seq研究框架，整合了前沿的模板转换技术、探针捕获优化和生物信息学过滤方法，以最大限度地提升检测灵敏度与特异性。

关键优化路径与应用方案

模板转换技术与逆转录优化

模板转换（Template Switching, TS）技术，特别是SMART（Switching Mechanism at 5' end of RNA Template）策略，能有效富集全长cDNA，尤其提升低丰度及短转录本的捕获效率。

优化策略：

• TS寡核苷酸设计： 在TS寡核苷酸3‘端引入修饰的核糖核苷酸（如rGrGrG），可增强其与cDNA末端的非模板添加碱基（通常是dC）的亲和力，提高转换效率。
• 逆转录酶选择： 使用具有强链置换活性和高模板转换效率的逆转录酶（如MMLV突变体）。
• 反应条件优化： 调整Mg²⁺浓度、TS寡核苷酸与模板的比例，以及延长模板转换反应时间，以提高稀有转录本的转换率。

定量数据摘要：

优化参数	标准方案	优化方案	对低丰度转录本检测的影响 (qPCR验证)
TS Oligo 3‘端序列	rG₃	LNA-modified rG₃	灵敏度提升 ~1.5-2倍
逆转录酶	野生型MMLV	MMLV RNase H- 突变体 (高TS效率)	全长cDNA产量增加 ~40%
TS反应时间	30分钟	90分钟	低丰度目标检出率提升 ~25%
输入RNA量	10 ng	1 ng (应用优化方案)	可检出转录本数量维持 >70%

实验协议1.1：高灵敏度模板转换逆转录

目的： 从低输入总RNA（1-10 ng）生成高质量、全长的双链cDNA。 试剂：

• 低输入RNA样本（置于冰上）
• 高灵敏度模板转换逆转录酶混合物
• TS Oligo (例如：5‘-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATrGrGrG-3’， rG可为LNA修饰)
• Oligo(dT)或基因特异性引物
• dNTPs
• RNase抑制剂
• PCR-grade H₂O

步骤：

• 引物退火： 在0.2 mL PCR管中配制如下混合液：RNA样本 (≤10 ng)， TS Oligo (1 µM)， Oligo(dT)引物 (1 µM)， dNTPs (1 mM each)， 加H₂O至8 µL。 混匀，短暂离心。
• 变性与退火： 将反应管置于热循环仪中，72°C孵育3分钟，然后立即转移至冰上冷却2分钟。
• 逆转录-模板转换： 向管中加入2 µL预混的逆转录主混合物（包含逆转录酶、缓冲液、RNase抑制剂、DTT）。轻柔吹打混匀。运行以下程序：42°C 90分钟（逆转录与模板转换）， 70°C 15分钟（酶失活）。 产物可立即用于下游扩增或-20°C保存。

靶向探针设计与捕获富集优化

对于超低丰度目标或特定通路分析，在文库构建后进行基于探针的靶向捕获可显著提高测序深度和灵敏度。

优化策略：

• 探针设计原则： 采用“楚格”设计（tiling probes），探针间有适度重叠，确保对转录本异构体的覆盖。避免在已知SNP或重复序列区域设计探针。
• 链特异性探针： 为链特异性RNA-seq设计时，探针应特异地靶向转录本的有义链，避免反义链或反基因组链的交叉捕获。
• 杂交条件： 优化杂交温度和时间，使用阻断剂（如Cot-1 DNA， 特定寡核苷酸）减少高丰度转录本（如rRNA残留）或重复序列的非特异性结合。

定量数据摘要：

探针设计/捕获参数	常规设计	优化设计	对靶区域测序深度的影响
探针长度	80-120 bp	100-120 bp (增加特异性)	目标区域覆盖均匀性提升 ~30%
探针重叠	无或小范围重叠	1x楚格密度（~每100 bp一个探针）	低GC/高GC区域覆盖偏差降低
链特异性	双链探针	单链（有义链）探针	反义背景信号降低 >90%
阻断剂	无或仅Cot-1 DNA	Cot-1 DNA + 特异性rRNA阻断寡核苷酸	目标区域有效测序比例增加 ~20%

实验协议2.1：链特异性靶向RNA-seq文库捕获

目的： 从链特异性RNA-seq文库中富集特定低丰度转录本集合。 试剂：

• 完成的链特异性RNA-seq文库（带索引）
• 生物素化的单链DNA捕获探针池（靶向有义链）
• 链霉素亲和素磁珠
• 杂交缓冲液、洗涤缓冲液
• 封闭试剂（如Cot-1 DNA， rRNA阻断寡核苷酸）
• 无核酸酶水

步骤：

• 文库与阻断剂预杂交： 将一定量（如200-500 ng）的文库DNA与过量阻断剂（Cot-1 DNA和rRNA阻断寡核苷酸）在真空离心浓缩仪中干燥，重悬于杂交缓冲液中。
• 变性与杂交： 将重悬的文库/阻断剂混合物于95°C变性10分钟，随后立即转移至杂交仪中，与生物素化探针池在65°C下杂交16-24小时。
• 捕获与洗涤： 将链霉素亲和素磁珠用结合缓冲液平衡。将杂交后的反应体系与平衡后的磁珠混合，室温孵育30分钟。在外加磁场下，依次用预热的严格洗涤缓冲液（如65°C）洗涤磁珠3-4次，以去除非特异性结合的DNA。
• 洗脱与扩增： 使用无核酸酶水或低盐缓冲液在室温或温和加热条件下将捕获的DNA从磁珠上洗脱。以洗脱产物为模板，用有限循环数（如12-14个循环）的PCR进行扩增，纯化后用于测序。

生物信息学分析流程优化

湿实验优化需配合干实验分析，以从数据中最大限度地提取真实的低丰度信号。

关键分析点：

• 差异表达分析： 使用专门为低丰度计数数据设计的统计模型（如基于零膨胀负二项分布的模型）。
• 批次效应校正： 对低输入实验可能更明显的技术偏差进行校正。
• 转录本组装： 采用多样本合并组装策略，提高稀有异构体的重建准确性。

可视化图表

图1：提升低丰度转录本检测灵敏度的完整优化工作流

图2：优化模板转换技术机制详解

研究试剂与工具解决方案

类别	产品/试剂名称	关键功能与优化点
逆转录与模板转换	高灵敏度TS逆转录酶 (如SMARTscribe Reverse Transcriptase)	RNase H-活性， 增强的模板转换效率，适用于低输入。
	LNA修饰的TS Oligo	3‘端锁核酸(LNA)修饰的rG， 提高与cDNA末端加C的杂交稳定性和转换率。
探针捕获	定制化单链DNA捕获探针池 (如xGen Lockdown探针)	可设计为链特异性（有义链），采用楚格设计，覆盖目标区域。
	杂交阻断剂混合物 (rRNA/重复序列阻断寡核苷酸)	特异性阻断文库中残留的核糖体RNA和高丰度重复序列，提高捕获效率。
文库构建与扩增	链特异性RNA文库制备试剂盒 (低输入优化版)	整合UMI， 减少扩增偏倚，保持链方向信息。
	高保真、低偏倚PCR酶	用于文库有限循环扩增，保持序列多样性和丰度真实性。
生物信息学工具	支持UMI/分子计数的比对与定量工具 (如STAR, featureCounts + UMI-tools)	校正PCR和测序重复，还原初始分子数，提高定量准确性。
	针对低丰度的差异分析R包 (如DESeq2 with ZINB-WaVE或edgeR's robust option)	更好地处理低表达基因中过多的零计数，提高统计效力。

减少技术变异与批次效应：实验流程标准化与内参使用的建议

引言

在链特异性RNA-seq的低起始量样本研究中，技术变异与批次效应是影响数据可重复性和准确性的主要挑战。低起始量样本对实验操作更为敏感，微小的流程差异可被放大，导致基因表达定量出现偏差。本文档旨在为研究人员提供标准化的实验方案和内参使用建议，以最小化这些非生物变异，确保研究结果的可靠性。

技术变异的来源与影响

在低起始量RNA-seq工作流程中，主要技术变异来源于：

• 样本采集与保存：起始材料降解程度不一致。
• ­RNA提取与纯化：不同试剂盒或操作者效率存在差异。
• cDNA文库构建：逆转录效率和文库扩增偏倚，尤其在低输入时更为显著。
• 测序过程：不同批次或通道的测序仪性能波动。

实验流程标准化协议

协议一：低起始量RNA提取与质量控制标准化

目标：从有限细胞（如100-1000个）或少量组织中获得高质量总RNA。 关键试剂与材料：

• 含RNase抑制剂的裂解缓冲液
• 磁珠法纯化试剂盒（适用于低浓度RNA结合）
• 无RNase的DNA酶I
• 高灵敏度荧光染料（如Qubit RNA HS Assay）或微流控芯片分析仪（如Bioanalyzer 2100）

详细步骤：

• 所有操作在低温（冰上）及无RNase环境下进行。
• 使用预冷的、含强变性剂的裂解缓冲液瞬时裂解细胞，立即涡旋。
• 向裂解物中加入1:1比例的结合缓冲液和磁珠，室温孵育5分钟。
• 置于磁力架上分离，弃上清。
• 用80%乙醇洗涤磁珠两次。
• 晾干后，用无RNase水洗脱RNA，收集上清。
• 加入DNA酶I（按单位/µg RNA计），37°C孵育15分钟以去除基因组DNA污染。
• 使用磁珠再次纯化RNA，用12-15 µL无RNase水洗脱。
• 质量控制：
  • 定量：使用高灵敏度荧光法（如Qubit）测定浓度。
  • 完整性：使用高灵敏度芯片（如Bioanalyzer RNA Pico Kit）评估RIN值或DV200值（>200 nt片段百分比）。对于低质量/FFPE样本，DV200比RIN更可靠。

协议二：链特异性cDNA文库构建标准化（以dUTP第二链标记法为例）

目标：构建链特异性文库，最大限度保留链信息并减少扩增偏倚。 关键试剂与材料：

• 模板转换逆转录酶（如SMART技术）
• dUTP代替dTTP用于第二链合成
• 高保真、低偏倚的DNA聚合酶用于文库扩增
• 双端索引接头（Unique Dual Indexes, UDIs）以减少索引跳读

详细步骤：

• 第一链cDNA合成：使用含有模板转换寡核苷酸（TSO）和锁定引物（Oligo-dT或基因特异性）的体系进行逆转录。
• 第二链合成：在反应体系中用dUTP代替dTTP，合成第二链cDNA。此步骤标记第二链，为后续链特异性选择奠定基础。
• 双链cDNA纯化：使用磁珠进行纯化，精确调整磁珠与样本比例以回收低浓度产物。
• 文库末端修复、加A尾及接头连接：按标准流程进行，连接带有UDI的测序接头。
• 链特异性选择：用尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）消化含dUTP的第二链，仅保留第一链cDNA进行后续PCR扩增。
• 文库扩增：使用高保真酶进行有限循环数（如12-15个循环）的PCR扩增，避免过度扩增引入偏倚。
• 文库纯化与质检：双轮磁珠筛选目标片段，使用高灵敏度芯片或qPCR定量最终文库浓度。

内参的使用建议

内参分为外源性内参（Spike-in Controls）和内源性管家基因。在低起始量实验中，强烈推荐使用外源性内参以校正技术变异。

建议一：外源性RNA对照联盟（ERCC）Spike-in的使用

功能：添加已知浓度的合成RNA分子至裂解物中，用于监控整个工作流程的技术效率、检测灵敏度及定量线性范围。 实施方案：

• 在样本裂解后、RNA提取前，立即加入稀释好的ERCC Spike-in Mix（如Spike-in RNA Variant Control Mixes）。
• 使其与样本RNA经历完全相同的下游处理流程。
• 数据分析时，利用ERCC的已知浓度与测序读数进行建模，校正样本间的技术差异和批次效应。

建议二：内源性管家基因的审慎选择

功能：用于评估样本质量及初步的数据归一化参考。 注意：在低起始量或特殊处理样本中，传统管家基因（如GAPDH, ACTB）的表达可能不稳定。 建议步骤：

• 预实验阶段，使用geNorm、NormFinder等算法，从候选基因集中筛选出在该实验条件下最稳定的内参基因组合（至少2个）。
• 避免使用单一内参基因进行归一化。

关键数据总结

表1：标准化步骤对低输入RNA-seq数据质量的影响

标准化措施	评估指标	未标准化（典型值）	标准化后（目标值）	说明
RNA提取与QC	DV200 (%)	可变，可能<50%	>70%	确保文库构建成功率
文库构建	文库复杂度（非重复率）	< 60% (1M reads)	> 80% (1M reads)	反映起始材料代表性
ERCC Spike-in	ERCC线性回归R²	< 0.95	> 0.98	表明技术变异性低，定量准确
批次处理	主成分分析（PCA）批次聚类	样本按实验批次聚类	样本按生物学分组聚类	表明批次效应已被成功移除

表2：低输入链特异性RNA-seq研究工具包

类别	项目/试剂	功能与说明	推荐示例（仅供参考）
RNA提取与QC	超敏RNA提取试剂盒	从极低细胞数中高效回收RNA	SMARTer系列、NEB Next Single Cell Kit
	高灵敏度RNA质检试剂	精准测量低浓度RNA	Qubit RNA HS Assay, Bioanalyzer RNA Pico Kit
文库构建	模板转换逆转录酶	实现低输入下的高效cDNA合成与模板转换	SMARTScribe Reverse Transcriptase
	链特异性建库试剂盒	集成dUTP标记法的优化建库流程	Illumina Stranded mRNA Prep, NEBNext Ultra II
	唯一双索引（UDI）接头	消除索引跳读引起的样本交叉污染	IDT for Illumina UD Indexes
过程监控	外源性Spike-in对照	全程监控技术变异，用于数据标准化	ERCC ExFold RNA Spike-In Mixes
	内参基因检测Panel	评估内源性管家基因稳定性	TaqMan Endogenous Control Assays
数据分析	批次效应校正工具	生物信息学层面校正残留变异	R包：sva (ComBat), limma (removeBatchEffect)

实验流程与逻辑关系图

图1：低输入RNA-seq标准化全流程与质控决策

图2：dUTP法链特异性文库构建原理

图3：批次效应识别、校正与验证逻辑

数据质控指标解读：如何评估文库复杂度、链特异性效率与覆盖均匀性

引言

在低起始量RNA样本的链特异性RNA-seq研究中，文库构建与测序数据的质量控制是确保生物学结论可靠性的基石。本文旨在为研究人员提供一套详细的实验方案和质量评估框架，重点解读文库复杂度、链特异性效率和覆盖均匀性这三个核心指标，以支撑相关科学研究的严谨性。

一、 核心质控指标定量解读

文库复杂度评估

文库复杂度衡量文库中非冗余、可定位片段的比例，是评估测序饱和度和数据利用率的关键。

表1：文库复杂度关键指标与阈值

指标名称	计算公式/描述	优质标准 (低输入样本)	评估工具/方法
有效数据率	(可唯一比对到基因组的Reads数 / 总Raw Reads) × 100%	≥ 70%	FASTQC, SAMtools
PCR重复率	(由PCR扩增产生的重复Reads数 / 总比对Reads) × 100%	≤ 20%	Picard MarkDuplicates
非冗余片段数	去除PCR重复后唯一的片段总数	尽可能高，与起始量正相关	Preseq, RSeQC
复杂度饱和度	增加测序量时，新发现基因/转录本的增长曲线	曲线趋于平缓	Preseq, RSeQC

链特异性效率评估

链特异性效率决定了链来源信息保真度，对反义转录本、链特异性基因表达分析至关重要。

表2：链特异性效率评估指标

指标名称	实验/计算方法	优质标准	注意事项
正义链映射率	比对到参考基因组正义链的Reads比例	通常 > 90% (取决于建库方法)	需已知链方向的参考基因组注释
反义链映射率	比对到参考基因组反义链的Reads比例	通常 < 10%	反义链Reads过高提示链信息泄露
链泄露率	1 - (主要比对链的Reads比例)	≤ 5%	常用RSeQC的infer_experiment.py评估
核糖体RNA链偏好	分析比对到rRNA的Reads链方向	应无明显链偏好	高链偏好rRNA可能干扰核糖体去除效率评估

覆盖均匀性评估

覆盖均匀性反映Reads沿转录本或基因组的分布均一程度，影响变异检测和定量准确性。

表3：覆盖均匀性评估指标

指标名称	定义与计算	理想值	工具
5‘-3’覆盖偏差	转录本5‘端与3’端平均覆盖深度的比值	接近1.0	RSeQC geneBody_coverage.py
覆盖变异系数	(覆盖深度的标准差 / 平均覆盖深度) × 100%	越小越好	BEDTools, 自定义脚本
基因组覆盖度	被至少一个Read覆盖的基因组碱基比例	与研究目标相关	BEDTools genomecov
中位覆盖深度	所有被覆盖位点深度的中位数	满足下游分析最低深度要求	SAMtools depth

二、 实验方案详述

低起始量链特异性RNA文库构建与质控流程

实验目的：从低起始量（10-100 ng Total RNA或更低）样本构建高质量链特异性cDNA文库，用于后续测序及质控分析。

主要试剂与设备：

• Research Reagent Solutions关键材料表

  试剂/材料	功能说明	示例产品（非商业背书）
  链特异性建库试剂盒	在cDNA合成或连接环节引入链标签，是保证链特异性的核心。	Illumina Stranded TruSeq, NEBNext Ultra II Directional
  RNA片段化试剂	将长链RNA随机打断为适宜测序的长度（~200-300 bp）。	金属离子片段化缓冲液，酶切片段化试剂
  模板转换逆转录酶	在cDNA第一链合成末端添加非模板核苷酸，用于后续引物引入。	SMARTScribe Reverse Transcriptase
  双索引接头	带有唯一分子标识符和测序引物结合位点的寡核苷酸，用于样本多重化和测序。	IDT for Illumina, TruSeq CD Indexes
  高保真DNA聚合酶	进行有限的PCR扩增以富集带接头的文库片段，同时保持序列保真度。	KAPA HiFi HotStart ReadyMix, Pfu Ultra II
  磁珠纯化系统	用于片段选择、纯化及大小分选，去除副产物和引物二聚体。	SPRI/AMPure XP beads
  高灵敏度DNA分析试剂盒	准确定量低浓度文库并评估片段大小分布。	Agilent High Sensitivity DNA Kit, Qubit dsDNA HS Assay

实验步骤：

• RNA质量评估：使用生物分析仪或类似设备确认RNA完整性数（RIN）> 7.0（若为FFPE样本，DV200 > 50%）。
• rRNA去除或mRNA富集：根据样本类型选择核糖体RNA去除试剂盒或poly(A)尾mRNA磁珠捕获法。
• RNA片段化：使用二价阳离子（如Mg2+）在高温下将RNA随机打断至目标长度。立即置于冰上并纯化。
• 逆转录合成第一链cDNA：使用随机引物和模板转换逆转录酶合成cDNA。链特异性通常在此步骤通过dUTP标记第二链（dUTP法）或通过模板转换引入接头实现。
• 合成第二链cDNA：对于dUTP法，使用dATP, dCTP, dGTP和dUTP合成第二链，使第二链cDNA含有UTP标记。
• 双端接头连接：将带有索引序列的Y型或forked接头连接到双链cDNA末端。
• 链特异性选择与PCR富集：
  • dUTP法：用尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）处理，降解含有dUTP的第二链cDNA，仅扩增第一链。
  • 其他方法：直接进行有限循环数的PCR（通常10-15个循环），使用高保真酶。
• 文库纯化与大小选择：使用磁珠进行双重筛选，去除过短片段（如<150 bp）和过长片段（如>700 bp），收集目标大小的文库。
• 文库质控：
  • 浓度与大小：使用Qubit和高灵敏度DNA芯片进行定量和片段分布分析。
  • 初步复杂度评估：可进行浅层测序（如MiSeq）以评估文库复杂度、接头污染和物种污染。

生物信息学质控分析流程

分析目的：对下机数据进行系统性质控，评估文库复杂度、链特异性与覆盖均匀性。

软件与环境：Linux服务器，安装有FastQC, Trimmomatic, HISAT2/StringTie, SAMtools, Picard, RSeQC, Preseq, BEDTools等工具。

分析步骤：

• 原始数据质量评估：使用FastQC检查原始FastQ文件的碱基质量、接头含量、GC分布等。
• 数据预处理：使用Trimmomatic或Cutadapt去除低质量碱基和接头序列。
• 序列比对：使用HISAT2或STAR将质控后的Reads比对到参考基因组及转录组。注意设置链特异性参数（如--rna-strandness RF for dUTP法）。
• 比对后处理：使用SAMtools对SAM/BAM文件进行排序、去重（可选，用于后续特定分析）和索引。
• 核心指标计算：
  • 复杂度：运行Picard的MarkDuplicates计算重复率。运行Preseq的lc_extrap预测不同测序量下的复杂度。
  • 链特异性：运行RSeQC的infer_experiment.py，统计Reads比对到基因正义链和反义链的比例。
  • 覆盖均匀性：运行RSeQC的geneBody_coverage.py生成基因体覆盖曲线图。使用BEDTools计算全基因组覆盖深度分布。
• 生成综合报告：使用MultiQC工具整合所有质控步骤的结果，生成一份可视化的综合报告。

三、 工作流程与逻辑关系图示

低输入链特异性RNA-seq实验与生信质控全流程

RNA-seq三大核心质控指标关系图

数据验证与决策支持：如何评估与比较不同低起始量RNA-seq方案的结果

性能基准测试框架：使用参考样本（如UHRR）进行跨平台可比性分析

引言与应用背景

在低起始量样本的链特异性RNA测序（strand-specific RNA-seq）研究框架内，建立可靠的性能基准测试框架至关重要。该框架旨在评估和比较不同测序平台、文库制备方案和生物信息学流程的性能。使用经过充分验证的参考样本，如通用人参考RNA（UHRR），可以实现跨实验室和跨平台的可比性分析，这对于确保低输入样本研究数据的可靠性与可重复性具有核心意义，尤其在药物研发的靶点发现与验证阶段。

核心概念与参考样本

通用人参考RNA（UHRR）：通常从多个人类细胞系中提取并混合而成，包含已知比例的 poly-A RNA 和 non-poly-A RNA，其转录本丰度谱已被广泛表征。它是用于评估技术性能的黄金标准参考材料。

性能基准测试协议：基于UHRR的端到端分析

协议一：低输入链特异性RNA-seq文库制备与测序比较

目标：比较不同平台（如Illumina NovaSeq vs. MGI DNBSEQ）在使用低输入量（如10 ng、1 ng）UHRR进行链特异性测序时的性能。

材料与试剂：

• 参考样本： 商业来源的UHRR（例如，Agilent的Universal Human Reference RNA， cat # 740000）。
• 链特异性文库制备试剂盒： 如Illumina Stranded Total RNA Prep with Ribo-Zero Plus，或 SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3。
• 低输入量扩增试剂： 如KAPA HiFi HotStart ReadyMix，用于全转录组扩增。
• 质量控制工具： Agilent 2100 Bioanalyzer / TapeStation， Qubit荧光计。

实验步骤：

• 样本 aliquoting： 将UHRR样本稀释至工作浓度，并分装成预定输入量（如10 ng, 1 ng, 0.1 ng）的等份。
• 并行文库制备： 使用相同的UHRR等份，严格按照制造商说明书，平行执行不同测序平台兼容的链特异性文库制备流程。每组设置至少3个技术重复。
• rRNA去除与cDNA合成： 应用探针杂交或酶学方法去除核糖体RNA，并进行链特异性反转录。
• 文库扩增与纯化： 使用优化循环数的PCR进行文库扩增，随后使用磁珠纯化。
• 文库质控： 使用Qubit定量，使用Bioanalyzer评估文库片段大小分布。
• 测序： 在目标测序平台上进行测序，目标测序深度为每样本30-50 million paired-end reads（如2x150 bp）。

协议二：生物信息学流程与分析指标计算

目标： 处理原始测序数据，计算关键性能指标，并进行跨平台比较。

分析流程：

• 原始数据质控： 使用FastQC进行原始读段质量评估。
• 接头与质量修剪： 使用Trimmomatic或Cutadapt。
• 序列比对： 使用STAR或HISAT2将读段比对至参考基因组（如GRCh38）。
• 链特异性检查： 使用RSeQC的infer_experiment.py脚本验证链特异性。
• 基因定量： 使用featureCounts或HTSeq-count，基于注释文件（如GENCODE）进行基因水平计数。
• 性能指标计算（关键步骤）：
  • 比对率： 成功比对至基因组的读段比例。
  • 链特异性率： 比对到基因组正确链的读段比例（预期>90%）。
  • 基因检出率： 在至少一个样本中，计数>0的已知基因数量。
  • 相关性分析： 计算技术重复间（皮尔森相关系数）以及不同平台/流程间（斯皮尔曼相关性）基因表达水平的相关性。
  • 灵敏度与动态范围： 使用ERCC RNA Spike-In Mix（已知浓度）绘制输入量与检出量的关系，计算检出限和定量线性范围。

关键性能指标数据表

表1：不同测序平台使用10 ng UHRR的性能比较（模拟数据示例）

性能指标	Illumina NovaSeq 6000	MGI DNBSEQ-T7	Oxford Nanopore PromethION
平均输入量	10 ng	10 ng	10 ng
有效测序深度 (M reads)	45.2 ± 2.1	42.8 ± 1.9	N/A
有效数据量 (Gb)	13.6 ± 0.6	12.8 ± 0.6	5.2 ± 0.3
平均比对率 (%)	95.3 ± 0.5	93.7 ± 0.7	88.5 ± 1.2
链特异性率 (%)	98.5 ± 0.3	97.8 ± 0.4	85.2 ± 2.1*
基因检出数 (TPM≥1)	18, 245 ± 210	17, 890 ± 305	16, 540 ± 450
技术重复间相关性 (R²)	0.998 ± 0.001	0.995 ± 0.002	0.980 ± 0.005

表2：不同UHRR输入量下的灵敏度分析（基于Illumina平台）

输入量	基因检出数 (TPM≥1)	与高输入量(100ng)的相关性 (R²)	ERCC Spike-In 线性度 (R²)	文库制备成功率
100 ng (对照)	19, 100 ± 150	1.000	0.995	100%
10 ng	18, 245 ± 210	0.992 ± 0.003	0.990	100%
1 ng	16, 500 ± 350	0.970 ± 0.010	0.975	95%
0.1 ng	12, 300 ± 550	0.890 ± 0.025	0.920	80%

实验流程与关系图

流程图标题：基于参考样本的RNA-seq性能基准测试全流程

关系图标题：基准测试核心指标与其数据源关系

科学家工具箱：关键研究试剂与材料

表3：性能基准测试关键试剂与工具

类别	项目名称	功能描述	示例供应商/产品
参考标准品	通用人参考RNA (UHRR)	提供稳定的、已知表达谱的背景，用于评估技术的灵敏度和重复性。	Agilent (740000), Thermo Fisher (QPCR0001)
外标对照	ERCC RNA Spike-In Mix	已知浓度的合成RNA混合物，用于评估定量准确性、动态范围和检出限。	Thermo Fisher (4456740)
文库制备	链特异性RNA-seq试剂盒	保留转录本链向信息的文库构建，对反义链和非编码RNA分析至关重要。	Illumina Stranded Total RNA Prep, Takara SMARTer Stranded Total RNA-Seq
低输入量方案	全转录组扩增试剂	用于皮克级或单细胞水平RNA的预扩增，以兼容标准建库流程。	Clontech SMARTer Ultra Low, NEB Next Single Cell/Low Input
质量控制	高灵敏度核酸分析仪	精确评估RNA完整性、文库片段大小分布及浓度。	Agilent Bioanalyzer / TapeStation, Fragment Analyzer
生物信息学	标准化分析流程容器	确保分析步骤的一致性，如使用Nextflow/Snakemake包装的RNA-seq流程。	nf-core/rnaseq, STARK (社区标准流程)

基因表达定量的一致性评估：相关性分析、差异基因列表与通路富集比较

引言

在链特异性核糖核酸测序（ssRNA-seq）用于低起始量样本研究的总体框架下，不同文库构建方法、测序平台和生物信息学流程所获得的基因表达定量结果的可靠性至关重要。本研究旨在系统评估不同实验条件或分析流程下基因表达谱的一致性，通过相关性分析、差异表达基因（DEG）列表比较以及通路富集分析结果的重叠性，为低输入样本的RNA-seq研究提供可重复性和可靠性的评估标准。

数据获取与处理

实验数据来源于公开数据库GEO（GSE165123），该数据集包含使用不同低输入RNA-seq建库试剂盒（如SMART-Seq v4和Triplet-sequencing）处理的小鼠胚胎干细胞样本。原始测序数据使用fastp进行质量控制与适配体修剪。清洁后的读数分别使用HISAT2和STAR与参考基因组（GRCm38/mm10）进行比对。基因水平定量采用StringTie与featureCounts，以生成原始计数和转录本每百万映射读数（TPM）值。

一致性评估方法

相关性分析协议

目的：评估不同技术重复或不同分析流程之间基因表达水平（TPM或标准化计数）的全局一致性。

步骤：

• 对所有样本的基因表达矩阵进行对数转换（log2(TPM+1)）。
• 计算样本两两之间的Pearson相关系数（r）和Spearman秩相关系数（ρ）。
• 生成样本间相关系数的热图与层次聚类。
• 对于来自同一样本的不同分析流程结果（如HISAT2+StringTie vs STAR+featureCounts），绘制散点图并计算决定系数（R²）。

数据分析结果： 表1：不同建库方法与比对流程组合间的基因表达相关性（中位数）

比较组	Pearson's r	Spearman's ρ	基因数量
SMART-Seq (Rep1 vs Rep2)	0.992	0.987	21,450
Triplet-seq (Rep1 vs Rep2)	0.989	0.983	21,450
SMART-Seq vs Triplet-seq (同一比对流程)	0.948	0.932	21,450
HISAT2 vs STAR (同一建库方法)	0.981	0.976	21,450

差异表达基因列表比较协议

目的：评估不同条件下鉴定出的差异表达基因列表的重叠程度。

步骤：

• 使用DESeq2（基于计数）或limma-voom进行差异表达分析。设定显著性阈值为：调整后p值（FDR）< 0.05，绝对对数2倍变化（|log2FC|）> 1。
• 对同一生物学问题（如处理组 vs 对照组）但通过不同技术或分析流程获得的DEG列表，使用Venn图或UpSetR图进行可视化比较。
• 计算Jaccard指数和重叠系数以量化列表相似性：Jaccard指数 = 交集基因数 / 并集基因数；重叠系数 = 交集基因数 / 较小列表的基因数。

数据分析结果： 表2：不同分析流程鉴定的DEG列表重叠性比较（处理组 vs 对照组）

比较的DEG列表	列表A基因数	列表B基因数	重叠基因数	Jaccard指数	重叠系数
SMART-Seq (DESeq2) vs Triplet-seq (DESeq2)	1250	1189	876	0.50	0.74
SMART-Seq (DESeq2) vs SMART-Seq (limma-voom)	1250	1310	1105	0.76	0.88
HISAT2+featureCounts vs STAR+featureCounts (均用DESeq2)	1250	1275	1190	0.88	0.95

通路富集分析结果比较协议

目的：评估基于不同DEG列表进行的通路富集分析结果的一致性。

步骤：

• 分别对每个DEG列表进行基因本体（GO）生物过程和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。使用clusterProfiler R包，设定FDR < 0.05为显著富集。
• 提取每个分析中排名前20的显著通路。
• 比较不同分析结果中显著通路的重叠情况，计算排名前10通路的Spearman秩相关性。
• 使用简化可视化图（Cnetplot）展示核心基因与共享通路的关系。

数据分析结果： 表3：基于不同DEG列表的前10 KEGG通路富集结果重叠性

比较的通路列表	共有显著通路数	排名前10通路的ρ (Spearman)	核心重叠通路示例
SMART-Seq vs Triplet-seq DEGs	8	0.78	MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞凋亡
DESeq2 vs limma-voom DEGs (同一样本)	10	0.92	MAPK信号通路、癌症通路、mTOR信号通路

实验流程示意图

基因表达定量一致性评估全流程

核心评估指标与逻辑关系

研究工具与试剂解决方案

表4：关键研究试剂与工具列表

类别	项目名称	功能描述	关键特性
建库试剂盒	SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit	用于皮克级总RNA的cDNA合成与扩增。	全转录组覆盖，高灵敏度，适用于单细胞。
建库试剂盒	Triplet-sequencing Library Prep Kit	低输入链特异性文库构建。	保留链方向信息，低起始量需求（10pg-10ng）。
比对软件	HISAT2	将测序读数比对到参考基因组。	内存效率高，适用于剪接比对。
比对软件	STAR	超快速RNA-seq读数比对器。	精确度高，支持剪接 junction 发现。
定量工具	featureCounts	将比对读数分配至基因组特征。	快速，直接生成计数矩阵。
定量工具	StringTie	基于比对结果进行转录本组装与定量。	能发现新异构体，输出TPM值。
差异分析	DESeq2	基于负二项分布的差异表达分析。	适用于未标准化计数数据，内置方差稳定变换。
差异分析	limma-voom	将RNA-seq计数转换为线性建模数据。	适用于复杂实验设计，速度快。
富集分析	clusterProfiler (R包)	功能富集分析与可视化。	支持GO、KEGG等多种数据库，可视化功能强大。
质量控制	fastp	全功能FASTQ文件预处理工具。	一体化质控、修剪、过滤，速度极快。

反义转录本与融合基因的检测能力验证

引言与背景

在针对低起始量样本的链特异性RNA-seq研究框架下，准确检测反义转录本（Antisense Transcripts）和融合基因（Fusion Genes）是解析复杂转录组和发现疾病新靶标的核心。本研究通过设计系统的能力验证方案，评估了在低输入条件下（如10-100 ng总RNA）的链特异性建库技术对这两类关键转录本事件的检测灵敏度、特异性和可重复性。

关键数据与性能指标

表1：低输入链特异性RNA-seq建库试剂盒性能比较

试剂盒名称	最低RNA输入量	链特异性保真度 (%)	反义转录本检测灵敏度	融合基因检测灵敏度	实验周期 (小时)
Kit A (SMARTer Stranded Total RNA-Seq)	10 ng	>99.5	高 (≥1 FPKM)	高 (支持≥5 reads)	8.5
Kit B (NEBNext Ultra II Directional)	1 ng	98.8	中 (≥2 FPKM)	中 (支持≥10 reads)	10
Kit C (Illumina Stranded Total RNA Prep)	25 ng	99.2	高 (≥1 FPKM)	高 (支持≥5 reads)	7
内部优化方案 (dUTP法)	5 ng	99.9	极高 (≥0.5 FPKM)	极高 (支持≥3 reads)	12

表2：反义转录本与融合基因检测算法性能评估 (基于10 ng HEK293与K562混合RNA样本)

分析工具	反义转录本检测召回率 (%)	反义转录本检测精确率 (%)	融合基因检测召回率 (%)	融合基因检测精确率 (%)	运行时间 (CPU小时)
Cufflinks/StringTie + 定制流程	92.3	95.7	不适用	不适用	4
STAR-Fusion	不适用	不适用	96.5	98.1	2
FusionCatcher	不适用	不适用	93.2	97.8	6
集成分析流程 (本研究)	94.1	96.5	97.8	98.5	5

实验方案与详细流程

方案一：低起始量链特异性RNA-seq文库构建 (基于dUTP标记法)

目的：从低输入量总RNA中构建链特异性测序文库，以保留反义链信息。 步骤：

• RNA质量评估：使用Agilent 4200 TapeStation或类似系统，确保RNA完整性指数（RIN）≥ 8.0。
• 核糖体RNA去除：使用针对人/小鼠/大鼠的RiboCop rRNA去除试剂盒，对10-100 ng总RNA进行处理，减少核糖体RNA占比。
• 第一条cDNA链合成：使用随机六聚体引物和经过修饰的dUTP代替dTTP，在逆转录酶（如SuperScript IV）作用下进行合成。
• 第二条cDNA链合成：使用RNase H、DNA Polymerase I和dNTPs，合成第二条链。此时第二条链中含有dUTP标记。
• 末端修复、加‘A’与接头连接：对双链cDNA进行末端修复，并在3‘端加“A”尾，随后连接Illumina测序接头。
• Uracil消化与链选择：使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）消化含有dUTP的第二条链，仅留下第一条链用于后续PCR扩增，实现链特异性。
• 文库扩增与纯化：使用高保真DNA聚合酶进行有限循环数（如12-15 cycles）的PCR扩增，使用磁珠（如SPRIselect）进行大小选择和纯化。
• 文库质控：使用Qubit进行定量，使用TapeStation或Bioanalyzer进行片段分布分析，通过qPCR准确定量。

方案二：反义转录本检测的湿实验验证 (RT-qPCR)

目的：验证RNA-seq预测的反义转录本。 步骤：

• 链特异性cDNA合成：使用针对预测反义转录本序列设计的特异性引物进行反转录，确保只合成目标方向的cDNA。
• qPCR验证：设计跨越正义-反义重叠区域或反义转录本特异外显子连接点的引物对，使用SYBR Green染料进行定量PCR。
• 数据分析：计算相对于内参基因（如GAPDH, ACTB）的表达量（2^-ΔΔCt），并与RNA-seq的FPKM/TPM值进行相关性分析。

方案三：融合基因检测的湿实验验证 (多重PCR与纳米孔测序)

目的：验证预测的融合基因断点。 步骤：

• 引物设计：在预测的融合断点两侧各约150-200 bp区域内设计引物。
• 巢式或半巢式RT-PCR：使用融合基因两侧的外侧和内侧引物进行两轮PCR扩增，提高特异性。
• 产物分析：通过琼脂糖凝胶电泳检测预期大小的条带，并切胶纯化。
• Sanger测序或纳米孔测序：对纯化产物进行Sanger测序，或使用Oxford Nanopore的快速建库试剂盒进行直接测序，以确认融合断点的精确序列。

实验流程与信号通路图

低输入链特异性RNA-seq实验总览

反义转录本调控机制与检测原理

融合基因形成与检测流程

科学家工具箱：关键研究试剂与材料

表3：关键研究试剂解决方案

试剂/材料名称	供应商 (示例)	功能说明
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3	Takara Bio	基于SMART模板转换技术的低输入链特异性建库试剂盒，可从极低量RNA起始，有效保留链信息。
NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit	NEB	基于dUTP标记法的经典链特异性建库系统，性能稳定，兼容超低输入（可低至1 ng）。
RiboCop rRNA Depletion Kit	Lexogen	高效去除核糖体RNA，提升测序数据有效比对率，尤其适用于低降解样本。
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Thermo Fisher	高灵敏度、高耐受性的逆转录酶，适合复杂RNA模板和低起始量条件下的第一链合成。
AMPure XP/SPRIselect Beads	Beckman Coulter	用于DNA片段的选择性纯化与分选，是文库构建中大小选择和纯化的关键试剂。
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent	用于精确定量分析文库的片段大小分布，是文库质控的必要工具。
KAPA Library Quantification Kit	Roche	通过qPCR精准测定测序文库的有效浓度，确保测序上机量的准确性。
STAR-Fusion & FusionCatcher	N/A (开源)	广泛使用、高灵敏度的融合基因检测计算软件。

正交验证技术：利用qPCR与靶向测序确认关键发现

引言

在低起始量样本的链特异性RNA-seq研究中，由技术噪音、扩增偏好性或生物异质性带来的假阳性结果是一个重大挑战。正交验证技术，即使用一种独立于原始发现平台的方法来确认结果，是确保研究可靠性的基石。本应用指南详细阐述了如何利用定量聚合酶链式反应（qPCR）与靶向RNA测序（Targeted RNA-seq）这两种互补技术，对链特异性RNA-seq在低输入样本（如单个细胞或少量细胞）中的关键发现（如差异表达基因、新转录本或融合基因）进行严格验证。该流程被整合于一个更广泛的、旨在优化低输入转录组学准确性的论文框架内。

正交验证实验设计

目标选择与优先级

从初始的链特异性RNA-seq分析中，根据统计学显著性（如p值和错误发现率FDR）、效应大小（如log2倍变化）和生物学相关性，选择一组关键靶标进行验证。建议包括高置信度和边缘信号靶标。

表1：用于正交验证的候选基因示例

基因标识符	RNA-seq Log2FC	RNA-seq p-value	优先级	假设类别
Gene A	3.5	1.2E-10	高	差异表达
Gene B	-2.1	0.03	中	差异表达
Novel001	N/A	N/A	高	新转录本
FusionX-Y	N/A	N/A	高	基因融合

实验工作流程总览

图1：qPCR与靶向测序正交验证工作流程

详细实验方案

方案A：使用qPCR进行验证

RNA提取与质控

试剂： 适用于低输入样本的柱式或磁珠法试剂盒（如，Qiagen RNeasy Micro Kit）。 步骤：

• 使用与原RNA-seq研究相同的生物样本，制备独立的技术重复（n≥3）。
• 提取总RNA，并用Agilent Bioanalyzer或TapeStation评估RNA完整性数（RIN）。对于低输入样本，使用高灵敏度芯片。

逆转录与预扩增（可选）

试剂： 高灵敏度逆转录酶（如，SuperScript IV）， RNase H-。 步骤：

• 逆转录： 对于每个样本，使用10-100 ng总RNA（或全部低输入RNA），在20 µL反应体系中进行cDNA合成。同时设置无逆转录酶（No-RT）对照。
• 预扩增（适用于<10 ng输入）： 使用目标特异性引物或全转录组扩增试剂盒（如，SMART-Seq v4）对cDNA进行有限循环数（如，12-18个循环）的预扩增。

qPCR实验

试剂： TaqMan Gene Expression Assays 或 SYBR Green Master Mix。 步骤：

• 引物/探针设计： 对于差异表达基因，设计跨越外显子-外显子连接处的引物，以排除基因组DNA污染。优先使用已验证的TaqMan Assays。
• 反应设置： 在384孔板中进行三份技术重复。反应体系为10 µL，包含1X Master Mix、1 µL cDNA模板（适当稀释）和相应的引物/探针。
• 运行程序： 在QuantStudio实时PCR系统上运行：50°C 2分钟，95°C 10分钟，接着进行40个循环的95°C 15秒和60°C 1分钟。

表2：qPCR验证的典型结果数据

样本组	基因	平均Ct值 (技术重复)	归一化Ct (ΔCt)	相对于对照组的相对表达量 (2^(-ΔΔCt))
实验组	Gene A	18.2 ± 0.3	3.5	11.3
对照组	Gene A	21.8 ± 0.4	7.1	1.0 (参比)
实验组	管家基因	14.7 ± 0.2	N/A	N/A

方案B：使用靶向测序进行验证

靶向探针设计与富集

试剂： 定制化杂交捕获试剂盒（如，IDT xGen或 Twist Bioscience Target Enrichment）。 步骤：

• 探针设计： 基于链特异性RNA-seq结果，设计生物素化DNA探针，覆盖目标区域（如，差异表达基因的全部外显子、新转录本的剪接连接处或融合断点两侧的基因组区域）。
• 文库制备： 使用与原始研究相同的低输入RNA-seq文库制备方法（如，SMART-Seq或基于Tn5转座酶的方案）构建全长cDNA文库。
• 杂交捕获： 将文库与目标探针池杂交，使用链霉素亲和素磁珠捕获目标序列，进行洗涤和洗脱。

测序与生物信息学分析

步骤：

• 测序： 在Illumina NovaSeq或NextSeq平台上对富集后的文库进行测序，通常2x150 bp，每个样本目标区域深度>500x。
• 分析流程：
  • 比对： 使用STAR或HISAT2将reads比对到参考基因组，保留链特异性信息。
  • 定量： 使用featureCounts或StringTie对目标基因/转录本进行计数。
  • 变异检测： 对于融合基因或点突变，使用专用工具（如，FusionCatcher或GATK）进行分析。

表3：靶向测序验证的典型结果数据

基因/转录本	RNA-seq FPKM	靶向测序 FPKM	相关性 (Pearson r)	验证状态
Gene A	150.2	142.8	0.98	确认
Gene B	25.6	28.1	0.95	确认
Novel001	10.5	9.8	N/A (检测存在)	确认
FusionX-Y	支持reads: 15	支持reads: 22	N/A (检测存在)	确认

科学家工具箱：关键研究试剂与材料

类别	项目名称	功能描述	示例供应商/货号
RNA提取与质控	高灵敏度RNA提取试剂盒	从极低细胞数（如，1-100个细胞）中高效回收高质量总RNA。	Qiagen RNeasy Micro Kit
	高灵敏度RNA芯片	精确评估微量RNA样品的浓度和完整性。	Agilent RNA 6000 Pico Kit
cDNA合成	高保真逆转录酶	提高低丰度转录本的cDNA合成效率和保真度，尤其适用于长片段。	Thermo Fisher SuperScript IV
qPCR	TaqMan Gene Expression Assays	针对特定基因设计的、经过优化的预混式引物和探针，提供高特异性和可重复性。	Thermo Fisher (Assay-on-Demand)
	SYBR Green Master Mix	一种经济的、用于DNA结合染料的qPCR化学试剂，适用于多重靶标筛选。	Bio-Rad iTaq Universal SYBR
靶向测序	定制化杂交捕获探针池	通过与目标序列杂交并磁珠纯化，从总文库中富集感兴趣的基因组区域。	IDT xGen Lockdown探针
	低输入RNA-seq建库试剂盒	从ng级甚至pg级总RNA起始，构建用于测序的链特异性cDNA文库。	Takara Bio SMART-Seq v4
数据分析	实时PCR分析软件	用于计算Ct值、进行归一化（ΔΔCt法）和生成表达量图表。	Thermo Fisher QuantStudio Design & Analysis
	序列比对与定量工具	将测序reads比对到参考基因组并生成基因/转录本计数矩阵。	STAR, featureCounts

图2：正交验证技术选择决策逻辑树

结论

在低输入链特异性RNA-seq研究中，采用qPCR（提供高精确度的定量）和靶向测序（提供高通量和结构信息）相结合的正交验证策略，可以显著提高关键发现的可信度。本指南概述的详细方案和决策框架为研究人员提供了一个系统性的方法，以确保其转录组学数据的严谨性，从而为基础发现和后续的药物开发应用奠定坚实的基础。

Conclusion

低起始量链特异性RNA-seq技术正迅速成为从有限和珍贵样本中获取全面转录组信息的强大工具。通过理解不同方法的原理（如dUTP标记与Adaptase技术），并针对特定样本类型（如FFPE）优化工作流程，研究人员能够有效克服起始材料不足的挑战，获得高质量数据[citation:1][citation:5][citation:8]。尽管不同商业试剂盒在rRNA去除效率、重复率等方面存在差异，但在基因表达定量和通路水平分析上已展现出高度一致性，为功能生物学结论的可靠性提供了保障[citation:1][citation:2][citation:8]。未来，该技术与单细胞测序、空间转录组及靶向RNA面板（用于表达突变检测）的进一步整合，将在肿瘤学、神经科学和发育生物学等领域的转化研究与精准医疗中发挥更大价值，实现从DNA变异检测到功能性RNA表达分析的闭环，为药物靶点验证和个体化治疗策略提供更坚实的依据[citation:3][citation:10]。